Les liposomes ou nanoparticules lipidiques sont des vésicules fermées largement utilisées pour l'encapsulation de différents types de molécules telles que l'ADN, les protéines, les médicaments et/ou d'autres produits chimiques. Dans cette brève revue, nous aborderons les méthodes de préparation les plus couramment utilisées, en mettant l'accent sur la microfluidique.
Une enveloppe de liposome est une bicouche phospholipidique qui agit comme une membrane biomimétique enfermant un compartiment liquide, comme schématisé à la Fig.1. Grâce à leur biocompatibilité extrêmement élevée, les liposomes présentent des applications utiles dans différents domaines et le développement de méthodes de préparation robustes est d'une grande importance.
Indépendamment des méthodes de préparation, les phospholipides sont des molécules amphiphiles qui s'organisent spontanément en liposomes en solutions aqueuses en raison de leur hydrophobicité. Ce processus réduit les interactions défavorables entre les chaînes acyles hydrophobes et la phase aqueuse environnante.
Selon la méthode spécifique utilisée pour la préparation des liposomes, la taille, la lamellarité et la dispersité des liposomes obtenus peuvent être très différentes. Les vésicules lipidiques utilisées dans les applications médicales sont généralement unilamellaires et ont un diamètre d'environ 100 nm.
Dispositifs microfluidiques pour la préparation de liposomes
Les méthodes les plus anciennes et traditionnelles pour la préparation des liposomes consistent en des techniques dites à macro-échelle ou en batch, basées sur la déshydratation initiale de films lipidiques suivie du processus de gonflement et de la manipulation mécanique finale pour créer les bicouches dispersées dans l'eau. Cependant, ces méthodes se caractérisent par une faible reproductibilité, un contrôle de processus limité et une utilisation inefficace des matériaux et réactifs.
La microfluidique a été récemment étudiée comme une méthode efficace pour la préparation de liposomes de manière contrôlée, reproductible et à haut débit. La microfluidique permet une réduction des volumes utilisés et des coûts associés en manipulant des fluides dans des compartiments géométriquement contraints, typiquement caractérisés par des échelles de longueur micrométriques et de faibles nombres de Reynolds.
Générateur de microgoutte
La focalisation de flux microfluidique est l'une des premières méthodes introduites et consiste en l'utilisation de puces microfluidiques avec une géométrie à flux croisés pour assurer l'intersection d'un flux central d'une solution alcoolique contenant les phospholipides avec une solution aqueuse. Typiquement, trois flux fusionnent dans le même canal microfluidique comme le montre la Fig.2. C'est le schéma typique des dispositifs microfluidiques adaptés à la génération de gouttelettes (cliquez ici pour voir quelques exemples). Comme vous pouvez le voir, une solution alcoolique de phospholipides est injectée dans un canal central flanqué de deux solutions aqueuses latérales. Le flux contenant les lipides est focalisé, et grâce 1) au faible nombre de Reynolds et 2) à la diffusion dominée par le transfert de masse, l'alcool diffuse dans la solution aqueuse et sa concentration dans le flux central commence à diminuer. Lorsqu'elle atteint une concentration critique inférieure à la solubilité des phospholipides, ceux-ci s'organisent spontanément en liposomes par auto-assemblage. Le rapport de débit volumétrique entre les flux de phase lipidique et aqueuse, ainsi que le débit total, influencent la taille des liposomes obtenus et leur ajustement permet une préparation contrôlée.
L'émulsion double est une variation de la méthode de focalisation de flux et consiste en la création d'une émulsion eau-dans-huile-dans-eau, dans laquelle une solution organique de toluène et de chloroforme est utilisée pour l'évaporation de la phase huileuse lors de la première étape. Une fois la phase huileuse retirée, les monocouches phospholipidiques qui représentent les interfaces huile-eau internes et externes entrent en contact avec la seconde phase aqueuse et s'assemblent en liposomes.
Cette méthode est techniquement exigeante car elle nécessite l'utilisation de deux puces différentes connectées en série et ayant un revêtement hydrophobe pour la première et hydrophile pour la seconde. L'efficacité pourrait également être faible en raison de l'étape d'émulsification au cours de laquelle la taille des vésicules et le taux de préparation affectent fortement 1) leur stabilité et 2) la concentration en phospholipides aux interfaces huile-eau. Ainsi, si les liposomes sont trop petits ou se forment trop rapidement et que les phospholipides ne sont pas encore stabilisés à l'interface, les gouttelettes ont tendance à se rompre facilement et à libérer leur contenu, réduisant l'efficacité d'encapsulation.
Mélangeur Herringbone
Récemment, le micromélange par la méthode Herringbone a été étudié et présente de grands avantages par rapport aux autres méthodes de préparation en termes d'efficacité de production de liposomes.
Par exemple, des liposomes pégylés ont été préparés avec succès en utilisant un mélangeur Herringbone (cliquez ici pour plus d'informations). Ce dispositif est un mélangeur à advection chaotique capable de perturber le flux laminaire typique des microcanaux, et de réduire le temps nécessaire au processus de préparation des liposomes. Le motif spécifique du dispositif composé de rainures herringbone redistribue les fluides en créant un flux transversal dans le microcanal.
The vertices of the grooves are offset to approximately one third of the width of the channel and two counter-rotating vortices are created by the grooves. The subsequent set of herringbone groves with a mirrored orientation of the vortices allows the creation of a full mixing cycle as shown in Fig.3. The alternation of these herringbone sets reorients the flow periodically and strongly improves the mixing. This microfluidic preparation method allows the controlled creation of liposomes of different sizes (∼100 nm) and good dispersity (< 0.2). By changing the flow rate parameters and the formulations in terms of aqueous buffer, phospholipid concentrations, and composition it is possible to finely tune the production of liposomes with the desired features.
Considérations finales
Il est clair que la microfluidique représente un avantage en tant que méthode de préparation de liposomes pour de nombreuses applications. Comparées aux méthodes macroscopiques ou par lots traditionnelles, les méthodes microfluidiques permettent une préparation de liposomes à haut débit de manière bien contrôlée et reproductible. Bien que les progrès aient été rapides, des améliorations supplémentaires sont encore nécessaires pour établir la microfluidique comme méthode de choix pour la préparation de liposomes, tant en laboratoire qu'à l'échelle industrielle.
Actuellement, les deux principaux obstacles à l'affirmation de la microfluidique comme méthode privilégiée pour la préparation des liposomes sont :
- Comme l'ont montré Björnmalm et al. (2014), il est difficile pour les chercheurs inexpérimentés en microfluidique d'avoir accès aux technologies microfluidiques.
- Carugo et al., (2016) et Sackmann et al., (2014) ont, quant à eux, mis en évidence le manque de soutien scientifique qualifié sur la manière dont la microfluidique pourrait répondre à leurs besoins spécifiques
Espérons que la disponibilité d'un nombre croissant de dispositifs microfluidiques innovants sur le marché et l'attitude de partage des connaissances de nombreux microfluidiciens expérimentés pourront désormais combler cette lacune et consolider la position de la microfluidique en tant que méthode préférable aux méthodes conventionnelles. Darwin Microfluidics s'engage dans cette révolution. Nous fournissons des dispositifs microfluidiques innovants pour la préparation de liposomes et notre équipe de scientifiques expérimentés et de PhDs offre le soutien dont les chercheurs ont besoin pour réussir leurs activités.
Références
- Björnmalm M. et al., Ingénierie et évaluation de particules pour l'administration de médicaments dans des dispositifs microfluidiques. Journal of Controlled Release 2014, 190: 139.
- Cheung C. C.L. et Al-Jamal W. T. Production de liposomes stabilisés stériquement utilisant un micromélangeur à chevrons décalés : Effet de la composition lipidique et de la teneur en PEG-lipides. International Journal of Pharmaceutics 2019, 566: 687.
- Carugo D. et al., Liposome production by microfluidics: potential and limiting factors. Scientific Reports 2016, 6: 25876.
- Deshpande S. et Dekker C. Production microfluidique sur puce de liposomes de taille cellulaire. Nature protocols 2018, 13 (5): 856.
- Sackmann E.K. et al., Le rôle actuel et futur de la microfluidique dans la recherche biomédicale. Nature 2014, 507: 181.
- van Swaay D. et DeMello A. Méthodes microfluidiques pour la formation de liposomes. Lab on Chip 2013, 13: 752.
- Williams M. S. et al., Un guide pratique du mélangeur à chevrons décalés herringbone. Lab on chip 2008, 8 (7): 1121.
