In biologia, gli sferoidi sono aggregati tridimensionali di cellule che riproducono l’architettura e la funzione dei tessuti. In ambienti che impediscono l’adesione alle superfici, le cellule possono infatti autoassemblarsi in strutture sferiche, chiamate sferoidi. Negli ultimi anni si è registrato un crescente interesse per queste strutture, poiché costituiscono un modello tridimensionale più vicino al microambiente in vivo delle cellule in un organismo vivente rispetto alla classica coltura cellulare bidimensionale. La coltura cellulare tridimensionale presenta numerosi vantaggi per la ricerca medica, come la creazione di modelli più predittivi a supporto dello sviluppo di nuove terapie.In questo articolo del blog esploreremo le basi della formazione degli sferoidi cellulari e approfondiremo le loro numerose applicazioni.
Formazione degli sferoidi - In che modo le cellule si aggregano?
Esistono diversi modi per formare gli sferoidi, ma i processi biologici alla base di questo raggruppamento cellulare sono piuttosto complessi e coinvolgono diversi meccanismi cellulari. Ciò richiede infatti l’adesione cellula-cellula tra cellule vicine attraverso recettori transmembranari presenti sulla superficie cellulare, chiamati integrine, che determinano l’aggregazione delle cellule. Ciò porta all’accumulo di un’altra proteina chiamata cadherina, coinvolta nell’adesione cellula-cellula. Successivamente, le cellule così assemblate creano giunzioni strette che rafforzano l’adesione cellulare iniziale e aumentano anche la compattazione dello sferoide. Inoltre, durante il processo di formazione degli sferoidi si verificano complessi processi di rimodellamento del citoscheletro, produzione della matrice extracellulare (ECM) e altre vie di segnalazione intracellulare.
Dopo la formazione iniziale, gli sferoidi possono continuare a crescere, in particolare quelli tumorali, e possono essere mantenuti in coltura per settimane. Possono essere sottoposti a trattamenti e altre condizioni sperimentali alle quali reagiranno modificando la propria architettura cellulare, secernendo molecole o manifestando altri comportamenti cellulari. Nel corso del tempo, tra gli strati cellulari interni e quelli esterni si formerà un gradiente di nutrienti e ossigeno. I normali processi cellulari possono subire alcune modifiche. Ad esempio, il tasso di proliferazione cellulare può essere influenzato nelle cellule del nucleo, meno esposte a nutrienti e ossigeno, portando all’apoptosi (morte cellulare programmata) o alla necrosi (morte cellulare incontrollata).
Quali sono le tecniche per formare sferoidi cellulari?
I diversi tipi di cellule presentano una propensione variabile a formare sferoidi; per questo motivo sono stati sviluppati diversi metodi per favorire l'aggregazione cellulare. Di seguito è riportato un elenco (non esaustivo) di tali tecniche:
- Alcuni tipi di cellule sono in grado di aggregarsi naturalmente, grazie all'espressione di molecole di adesione cellulare. Ad esempio, le cellule tumorali spesso si autoaggregano formando sferoidi, che alla fine danno origine a tumori.
- Sebbene alcune cellule possano essere relativamente inclini a formare aggregati, potrebbero anche trarre beneficio da un aiuto proveniente dall’ambiente. Tale aiuto può essere fornito mediante l’aggiunta di componenti biochimici che favoriscono l’adesione cellula-cellula, come le integrine, le caderine o i componenti della matrice extracellulare e molte altre molecole.
- È inoltre possibile utilizzare rivestimenti a bassa adesione o non aderenti sulle superfici del dispositivo utilizzato per l’aggregazione cellulare. Inoltre, la definizione fisica dell’ambiente potrebbe favorire la formazione di sferoidi grazie alla forma specifica dei pozzetti (come i pozzetti conici con sporgenze speciali che consentono uno scambio quasi completo del mezzo, come si vede nellemicropiastre AKURA diInSphero ) o alla microstrutturazione con motivi specifici sulla superficie per guidare l’aggregazione cellulare.
- Mantenere le cellule in sospensione tramite agitazione può impedire che si attacchino alla superficie e favorire i contatti tra le cellule. Sebbene si tratti di una procedura piuttosto semplice da mettere in atto, spesso comporta un’elevata variabilità nelle dimensioni degli sferoidi.
- Anche i campi elettrici e magnetici, gli ultrasuoni o le onde acustiche possono essere utilizzati per favorire l'aggregazione cellulare.
- La microfluidica può essere utilizzata anche per formare aggregati cellulari, con diversi vantaggi: minore impiego di reagenti, ambiente ben controllato, maggiore omogeneità dimensionale tra sferoidi dello stesso lotto e di lotti diversi, migliore modellizzazione e viabilità cellulare grazie alla fluidodinamica.
- Un’altra opzione molto diffusa è quella di utilizzare il metododelle gocce sospese. Questo metodo sfrutta la forza di gravità per facilitare le interazioni cellula-cellula all’interno di una goccia di terreno di coltura sospesa. Sebbene ciò possa essere fatto sul coperchio di una piastra di Petri, alcuni dispositivi sono stati sviluppati appositamente per migliorare la riproducibilità e la produzione ad alta produttività di queste gocce sospese.
Sintesi delle tecniche
| Tecnica | Descrizione |
|---|---|
| Aggregazione naturale | Espressione delle molecole di adesione cellulare. |
| Componenti biochimici | Favorire l'adesione cellula-cellula. |
| Rivestimenti a basso attaccamento o non aderenti | Migliorare la formazione degli sferoidi. |
| Contesto limitante | Indurre l'aggregazione cellulare tramite forme specifiche dei pozzetti o micropattern. |
| Sospensione e agitazione | Impedire l'adesione alla superficie e favorire i contatti cellula-cellula. |
| Campi fisici | Favorire il raggruppamento delle cellule utilizzando campi elettrici e magnetici, ultrasuoni o onde acustiche. |
| Microfluidica | Formazione di aggregati cellulari in ambienti controllati. |
| Goccia sospesa | Sfruttare la forza di gravità per facilitare le interazioni cellula-cellula in una goccia di terreno di coltura in sospensione. |
Quali altri fattori possono influenzare l'aggregazione cellulare?
- La densità cellulareha un impatto ed è importante determinare il numero ottimale di cellule per un dato volume, in modo da favorire interazioni cellula-cellula efficaci per una corretta formazione degli sferoidi. Se le cellule non sono sufficienti, i contatti cellula-cellula potrebbero risultare insufficienti, con conseguente scarsa aggregazione. D’altra parte, un numero eccessivo di cellule può causare un accesso limitato alle sostanze nutritive, stress cellulare e, infine, morte cellulare. Mantenere una densità cellulare costante contribuirà inoltre a ottenere sferoidi omogenei e uniformi, garantendo la riproducibilità degli esperimenti.
- Coltura cellularee condizioni ambientali:tutti i fattori importanti per la vitalità e la crescita cellulare influenzano anche la formazione degli sferoidi. È infatti importante disporre di livelli sufficienti di nutrienti e ossigeno, di temperatura, pH e livelli di CO₂ ottimali, nonché di una composizione del terreno di coltura adeguata al tipo di cellula scelto. Se le condizioni non sono ottimali, ciò potrebbe influire sulle interazioni e sulle comunicazioni cellulari e indurre stress cellulare fino alla morte cellulare. Anche i metaboliti prodotti dalle cellule all’interno dello sferoide influenzano le altre cellule. In particolare, i metaboliti prodotti dalle cellule situate al centro dello sferoide potrebbero non raggiungere le cellule degli strati esterni; di conseguenza, a seconda della loro posizione all’interno dello sferoide, le cellule non saranno esposte agli stessi metaboliti o alle stesse concentrazioni di questi. Ciò ha un impatto sulla comunicazione intercellulare e può anche influire sulle diverse fasi della formazione degli sferoidi. Anche le forze meccaniche e le condizioni contribuiscono alla formazione degli sferoidi, sia che siano naturali sia che siano determinate dal metodo di aggregazione scelto.
- Le molecole di adesione e i componenti della matrice extracellularesvolgono un ruolo importante nell'adesione e nell'aggregazione cellulare. Anche la promozione dell'espressione di queste molecole può costituire un parametro di regolazione.
Quali sono i tipi di sferoidi cellulari?
Esistono molti tipi di sferoidi, ognuno dei quali apporta un contributo unico alla ricerca:
Sferoidi tumorali multicellulari (MCTS)
Gli sferoidi tumorali multicellulari (MCTS) rivestono un ruolo fondamentale nella modellizzazione dei tumori solidi. Questi sferoidi, che rappresentano una via intermedia tra la coltura bidimensionale e i tumori in vivo, riproducono caratteristiche fondamentali dei tumori, quali la formazione di gradienti nutrizionali e lo sviluppo di un nucleo ipossico con minore accesso all’ossigeno, ma anche la comunicazione intercellulare fisiologica e l’eterogeneità cellulare. Simulando fedelmente il microambiente tumorale, gli MCTS sono essenziali per lo studio della biologia del cancro e per la sperimentazione di terapie antitumorali.
Fonte: Kamatar, A.; Gunay, G.; Acar, H. Biomateriali naturali e sintetici per l'ingegnerizzazione di sferoidi tumorali multicellulari. Polymers 2020, 12, 2506.
Sferoidi di cellule staminali
Derivati da cellule staminali pluripotenti indotte (iPS), possiedono la straordinaria capacità di differenziarsi in vari tipi cellulari. Questa versatilità li rende un elemento fondamentale nella ricerca sulla medicina rigenerativa e sull’ingegneria tissutale. Questi sferoidi forniscono informazioni sul comportamento delle cellule staminali e sulle potenziali applicazioni terapeutiche.
Corpi embrioidi (EB)
Rientranti nella categoria precedente, i corpi embrioidi (EB) si formano a partire da cellule staminali embrionali (ESC) e da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC). Sono utilizzati per studiare lo sviluppo embrionale precoce. Possono inoltre fungere da modello per l’ingegneria tissutale, la medicina rigenerativa e la specificazione del lignaggio cellulare.
Immagine in fase di corpi embrioidi (EB) in coltura in sospensione dopo 24 ore dalla loro formazione. Gli EB sono stati creati a partire da circa 1000 cellule staminali embrionali di topo (linea cellulare D3). Barra di scala = 100 µm.
Fonte: Corpo embrioide. (22 giugno 2024). In Wikipedia.
Sferoidi specifici per tessuto
Si tratta spesso di sferoidi in cocultura, che presentano diversi tipi cellulari per riprodurre la complessità dei tessuti, poiché questi ultimi di solito non sono costituiti da un unico tipo cellulare. Questi sferoidi facilitano lo studio delle interazioni cellula-cellula, l’ingegneria tissutale e la modellizzazione delle malattie. Essi forniscono un modello più rilevante dal punto di vista fisiologico, poiché incorporano diversi tipi cellulari che interagiscono all’interno di un tessuto.
Sferoidi epatici
Costituiti da cellule epatiche (epatociti, cellule non parenchimali, cellule stellate epatiche), questi sferoidi vengono utilizzati per modellare la funzione epatica e le patologie del fegato, studiare il metabolismo dei farmaci e condurre test di tossicità. Sono in grado di riprodurre attività specifiche del fegato, il che li rende uno strumento prezioso per gli studi epatologici.
Neurosfere
Derivate dalle cellule staminali neurali o dalle cellule progenitrici, le neurosfere vengono utilizzate per studiare la neurogenesi, la differenziazione neurale, le malattie neurodegenerative e l'ingegneria dei tessuti neurali. Esse offrono un modello dinamico per esplorare le complessità del sistema nervoso.
Cardiosfere
Composte da cellule progenitrici cardiache, le cardiosfere rivestono un ruolo fondamentale nella ricerca sulla rigenerazione cardiaca, nei modelli di malattie cardiache e nei test di cardiotossicità. Esse riproducono il microambiente cardiaco, fornendo informazioni sulla riparazione del tessuto cardiaco e sui meccanismi patologici.
Adiposfere
Formate da cellule del tessuto adiposo, le adiposfere vengono utilizzate per studiare l'adipogenesi, l'obesità, le malattie metaboliche e la sperimentazione farmacologica. Esse riproducono il comportamento e la funzione del tessuto adiposo, compresi l'accumulo di grasso e la secrezione ormonale.
Sulla base degli esempi sopra descritti, è possibile ipotizzare la creazione di sferoidi per tutti gli organi del corpo, a condizione che si riescano a definire condizioni sperimentali ottimali e che vengano condotti studi comparativi con i modelli esistenti e in vivo per convalidare la validità del modello.
Sferoidi immunitari
Questi aggregati comprendono cellule immunitarie, quali linfociti e macrofagi, e vengono utilizzati per lo studio delle risposte immunitarie, dell’immunoterapia e delle interazioni tra tumore e sistema immunitario. Sono fondamentali per comprendere in che modo le cellule immunitarie interagiscono con altre tipologie di cellule e come tali interazioni influenzino la progressione della malattia e gli esiti terapeutici.
Sfereidi vascolarizzati
Descrivono sferoidi appartenenti alle categorie sopra menzionate che contengono componenti vascolari o derivati da cellule endoteliali. Possono essere utilizzati nella ricerca sull’angiogenesi, sulla biologia vascolare e nei test farmacologici relativi alla formazione dei vasi sanguigni. Questi sferoidi aiutano a comprendere la formazione e la funzione dei vasi sanguigni, aspetto fondamentale per l’ingegneria tissutale e la ricerca sul cancro. La vascolarizzazione è essenziale per l’apporto di nutrienti e la sopravvivenza cellulare ed è quindi fondamentale anche per lo sviluppo di modelli di sferoidi fisiologici e rilevanti per diversi tipi di tessuto.
Sferoidi tumorali e rete vascolare realizzati in un dispositivo microfluidico.
Fonte: Nashimoto Y, Okada R, Hanada S, Arima Y, Nishiyama K, Miura T, Yokokawa R. Tumore vascolarizzato su chip: l’effetto della perfusione sulla crescita e sul rilascio di farmaci negli sferoidi tumorali.
Biomaterials. Gennaio 2020;229:119547. doi: 10.1016/j.biomaterials.2019.119547. Pubblicazione elettronica 17 ottobre 2019. PMID: 31710953.
In che modo gli sferoidi possono essere utilizzati nella ricerca medica?
Lo sviluppo delle colture sferoidali ha aperto una dimensione completamente nuova alla ricerca medica. Questi aggregati cellulari costituiscono modelli affidabili ed economici per approfondire la comprensione dei meccanismi patologici, delle vie biologiche, nonché dell’efficacia e della tossicità dei trattamenti. Rappresentano un nuovo modello in vitro e un’alternativa alla sperimentazione sugli animali per una maggiore prevedibilità e una migliore trasposizione alle sperimentazioni cliniche sull’uomo.
| Applicazione | Ruolo |
|---|---|
| Screening antidroga | Utilizzato per lo studio sia della tossicità che dell’efficacia di molecole di nuova concezione e di farmaci attualmente autorizzati, favorendo il riprofilamento dei farmaci. |
| Modellizzazione delle malattie | Consentire una migliore comprensione dei meccanismi patologici e la chiarificazione dei percorsi biologici. |
| Medicina personalizzata | Potrebbe essere utilizzato per individuare il trattamento più efficace per i singoli pazienti. |
| Ricerca sul cancro | Fornire un modello in vitro dei tumori di qualità superiore rispetto alle colture cellulari bidimensionali, favorendo lo studio dell'invasività tumorale, delle metastasi e lo sviluppo di terapie antitumorali. |
| Ingegneria dei tessuti | Vengono utilizzati come elementi costitutivi per sviluppare strutture 3D più grandi quando si fondono insieme diversi sferoidi. Possono inoltre essere impiegati per riparare o sostituire tessuti danneggiati. |
| Terapia cellulare | Utilizzato per somministrare cellule in modo fisiologico nell’ambito dello sviluppo delle terapie cellulari. |
In futuro si potranno probabilmente individuare molti altri modi per utilizzare gli sferoidi nella ricerca e nella terapia, soprattutto se si riuscirà a limitare gli attuali limiti di questi sferoidi.
Quali sono i limiti dell'utilizzo degli sferoidi cellulari?
Nonostante il suo ruolo fondamentale nella ricerca biomedica contemporanea, la coltura di sferoidi presenta ancora alcuni limiti:
📏 Limiti dimensionali e riproducibilità
Più uno sferoide è grande, più sarà soggetto a gradienti di nutrienti e, di conseguenza, a una potenziale necrosi cellulare al suo interno. Inoltre, è importante sviluppare un metodo di produzione che garantisca una buona omogeneità degli sferoidi, in modo da poter confrontare i risultati ottenuti da sferoidi diversi. È altresì importante tendere a sviluppare metodi standardizzati per ottenere dati riproducibili.
🤖Automazione e scalabilità
Sebbene in questo campo si registrino numerose innovazioni, è importante sviluppare sistemi automatizzati per la produzione e lo studio degli sferoidi, al fine di renderli utili alla ricerca medica su larga scala.
🧑🔬 Competenze tecniche
Inizialmente, il passaggio da 2D a 2D potrebbe richiedere alcuni adeguamenti delle attrezzature di laboratorio e una formazione tecnica.
🔎Analisi limitata
A causa della loro struttura tridimensionale, alcune tecniche di valutazione, come l’imaging, potrebbero risultare complesse. Potrebbe essere difficile accedere al centro dello sferoide e ciò potrebbe quindi limitare l’analisi agli strati esterni.
🧩 Complessità limitata
Sebbene siano più complessi dei monostrati bidimensionali, gli sferoidi presentano comunque una complessità inferiore rispetto ai tessuti nativi in termini di struttura, vascolarizzazione, numero di tipi cellulari e funzioni.
Conclusione
Gli sferoidi cellulari presentano caratteristiche molto promettenti per una ricerca più fisiologica, più predittiva e più efficiente. Il loro impiego in numerosi ambiti li rende uno strumento versatile e prezioso per ricercatori e professionisti del settore medico. La costante innovazione nel campo degli sferoidi registrata negli ultimi anni offre inoltre spunti promettenti sui potenziali miglioramenti futuri.
Fonti:
Białkowska K, Komorowski P, Bryszewska M, Miłowska K. Gli sferoidi come tipo di colture cellulari tridimensionali: esempi di metodi di preparazione e applicazioni principali. Int J Mol Sci. 28 agosto 2020;21(17):6225. doi: 10.3390/ijms21176225. PMID: 32872135; PMCID: PMC7503223.
Decarli MC, Amaral R, Santos DPD, Tofani LB, Katayama E, Rezende RA, Silva JVLD, Swiech K, Suazo CAT, Mota C, Moroni L, Moraes ÂM. Gli sferoidi cellulari come piattaforma di ricerca versatile: meccanismi di formazione, produzione ad alta produttività, caratterizzazione e applicazioni. Biofabrication. 8 aprile 2021;13(3). doi: 10.1088/1758-5090/abe6f2. PMID: 33592595.
Lazzari G., Couvreur P. e Mura S. (2017). Sferoidi tumorali multicellulari: un modello 3D rilevante per lo studio preclinico in vitro dei nanomedicinali polimerici. Polym. Chem. 8, 4947.
