L'applicazione della microfluidica in biologia e medicina offre nuove ed entusiasmanti possibilità per la coltura cellulare in vitro grazie a un maggiore controllo del microambiente cellulare.
Due argomenti importanti e interconnessi che emergono in questo campo sono l'organe sur puce e la coltura cellulare 3D. I potenti strumenti sviluppati con la microfabbricazione di un'ampia gamma di materiali polimerici e non polimerici nella microfluidica e nel micropatterning consentono una notevole diversità nell'ingegneria del microambiente. Ciò rende possibile lo sviluppo di modelli in vitro con caratteristiche senza precedenti in qualsiasi laboratorio, avvalendosi di metodi economici e rapidi. Non solo è possibile controllare il microambiente in modo efficiente, ma il ridotto volume di questi modelli consente un'efficiente parallelizzazione degli studi in vitro, riducendo i costi e consentendo uno screening dei farmaci a throughput elevato [1] [2].
Un'ampia gamma di materiali è a disposizione dei ricercatori che operano o intendono operare in questi settori, caratterizzati da molteplici proprietà in termini di biocompatibilità, caratteristiche ottiche e meccaniche, facilità di manipolazione e costi. Lo scopo di questa rassegna è presentare i materiali impiegati nella microfluidica che possono essere utilizzati anche per la coltura cellulare. Verranno brevemente esposti i rispettivi punti di forza e di debolezza.
Una problematica rilevante nel passaggio dalla coltura cellulare in vitro convenzionale a quella microfluidica riguarda la scala. A causa delle variazioni di scala, come il rapporto tra volume e superficie in tali dispositivi di coltura, le caratteristiche delle cellule colturate possono subire alterazioni significative. Ad esempio, il rapporto tra la superficie di coltura cellulare e il volume del mezzo varia drasticamente rispetto alle colture tradizionali. [3]
Termoindurenti
PDMS (polidimetilsilossano) è il materiale d'elezione per la microfluidica, grazie principalmente alla facilità del processo di microfabbricazione, alla sua trasparenza ottica, alle proprietà elastomeriche e alla capacità di legarsi in modo permanente al vetro o a se stesso. Tali proprietà rendono PDMS estremamente diffuso per la microfabbricazione di dispositivi microfluidici su scala di laboratorio.
Nell'ambito della coltura cellulare, la biocompatibilità e la permeabilità ai gas del PDMS lo rendono idoneo alla coltura cellulare all'interno di microcanali. Le sue proprietà ottiche, abbinate a una bassa autofluorescenza, lo rendono ideale per la rilevazione in fluorescenza; inoltre, può essere modellato e fatto aderire senza la necessità di una camera bianca, risultando attraente per i team di ricerca che si affacciano per la prima volta sulla microfluidica.
Tuttavia, il PDMS presenta alcuni svantaggi, in particolare per quanto concerne l'assorbimento di piccole molecole. Questo aspetto può risultare critico nella coltura cellulare per i test sui farmaci, poiché il PDMS è in grado di alterare significativamente le concentrazioni delle specie di interesse, un fattore determinante nel monitoraggio di concentrazioni nano e micromolari.[4]
Il PDMS è inoltre permeabile al vapore acqueo, pertanto il dispositivo potrebbe disidratarsi o presentare una concentrazione osmotica instabile nei canali.
Tali proprietà possono rendere l'impiego del PDMS piuttosto complesso per esperimenti prolungati. Ciononostante, il materiale rappresenta da tempo un punto fermo della microfluidica, supportato da una vasta letteratura che già tratta l'argomento.
Polimeri termoplastici per la coltura cellulare
I polimeri termoplastici, come il policarbonato e il polistirene, rappresentano un'altra categoria di materiali impiegati nella microfluidica e hanno trovato applicazione anche nella coltura cellulare. Il processo di microfabbricazione è rapido: passare dal materiale di base a un chip funzionale richiede pochi minuti ed è possibile adattarsi a qualsiasi scala, dalla prototipazione all'industrializzazione.
Presentano solitamente interfacce rigide, il che rende il processo di bonding più complesso rispetto al PDMS. Ciononostante, la vasta gamma di materiali termoplastici li rende promettenti per lo sviluppo di future applicazioni, poiché è possibile individuarne uno con caratteristiche adatte alle specifiche esigenze, mantenendo al contempo un processo produttivo analogo, pur con lievi modifiche.
Tra i materiali termoplastici utilizzati nella microfluidica e per la coltura cellulare figurano:
Il polistirene (PS) e il polimero di cicloolefina (COP)[5] si sono dimostrati idonei per la coltura cellulare, riducendo al contempo l'assorbimento di piccole molecole idrofobe e il rilascio di oligomeri non reticolati presenti nel PDMS.
Il copolimero di cicloolefina (COC) [6] [7] [8] costituisce una categoria di COP composta da molteplici tipologie di monomeri. Alcune varianti presentano un'elevata inerzia biologica e risultano idonee alla coltura cellulare di cellule HeLa in seguito a un trattamento al plasma d'aria. [9]
Il polimetilmetacrilato (PMMA) è un materiale termoplastico che può essere non solo stampato a caldo, ma anche inciso al laser, riducendo così il numero di componenti necessari per il processo di microfabbricazione. [10] [11] [12]
Il policarbonato (PC) è già un materiale ampiamente utilizzato nella coltura cellulare e trova impiego anche nella microfluidica. Tuttavia, la natura chiusa dei canali unita alla permeabilità nulla del materiale lo rende poco ideale per i vincoli specifici della microfluidica. Per questo motivo, il PC viene spesso impiegato in combinazione con il PDMS all'interno di chip ibridi allo scopo di generare gradienti di ossigeno sfruttando la sua bassa permeabilità all'ossigeno. [13]
È stato dimostrato che i materiali termoplastici come COC, PMMA e PC manifestano un'autofluorescenza significativamente superiore rispetto al PDMS, il che li rende inadatti per determinati metodi di rilevazione. [14]
Elastomero termoplastico morbido
L'impiego di materiali elastomerici morbidi riveste un grande interesse per l'intera disciplina della microfluidica. La bassa rigidità di tali materiali li rende sufficientemente deformabili da consentire la fabbricazione diretta di elementi meccanici integrati, come micropompe e valvole. Tale caratteristica rende notevolmente più agevole l'implementazione di funzioni complesse in materiali elastomerici come il PDMS. Un'altra categoria di materiali elastomerici è costituita dagli elastomeri termoplastici morbidi (sTPE). Si tratta di copolimeri a blocchi formati da una matrice elastomerica con domini termoplastici rigidi costituiti da molteplici blocchi sufficientemente piccoli da risultare continui alla scala del microdispositivo (µm). Ciò conferisce proprietà chimiche e un processo di stampaggio analoghi a quelli dei materiali termoplastici rigidi, coniugati con le proprietà elastomeriche che agevolano il bonding e la realizzazione di microstrutture meccaniche.
Il Flexdym [15] è un sTPE sviluppato per superare i limiti del PDMS nella microfluidica in termini di prototipazione rapida, adsorbimento, assorbimento e bonding dei substrati, preservandone al contempo i vantaggi quali morbidezza, proprietà ottiche, biocompatibilità e permeabilità ai gas. Può essere impiegato per la coltura cellulare grazie alla sua permeabilità ai gas (sebbene inferiore rispetto al PDMS) e consente una prototipazione estremamente rapida, richiedendo solo pochi minuti dal processo di stampaggio al chip sigillato finale. Inoltre, essendo iniettabile, la scalabilità a livello industriale risulta estremamente lineare.
I perfluoropolieteri (PFPE) [16] sono stati impiegati nella coltura cellulare e mostrano prestazioni analoghe a quelle dei chip in PDMS, principalmente grazie alla loro permeabilità ai gas. I PFPE sono materiali morbidi e trasparenti, caratteristiche che li rendono estremamente simili al PDMS. Possono essere strutturati direttamente mediante fotolitografia, il che rappresenta un vantaggio significativo poiché elimina la necessità di uno stampo e riduce il numero di fasi per la produzione dei microchip. Tuttavia, alcuni svantaggi sono rappresentati dai costi elevati e dall'altissima inerzia chimica del materiale, che rende complessa la modifica superficiale.
Il vetro [17] possiede proprietà di notevole interesse per la coltura cellulare microfluidica; in particolare, la sua stabilità chimica e le sue proprietà ottiche possono essere sfruttate per incrementare la ripetibilità delle misurazioni. Ciononostante, i processi di produzione complessi e onerosi ne fanno un materiale di nicchia sia nella ricerca che nell'industria. Il vetro rimane un materiale di fascia alta per la prototipazione, ma la versatilità dei trattamenti superficiali disponibili e la sua resistenza possono compensare i costi superiori, soprattutto nel caso di chip riutilizzabili.
La microfluidica su carta rappresenta un recente sviluppo per la produzione di applicazioni point-of-care a basso costo. L'impressione di microrreattori di coltura su carta mediante la modifica della superficie per potenziare l'adesione cellulare risulta particolarmente promettente per future diagnostiche economiche basate sul rilevamento cellulare. [18]
[1] Su, X., Young, E. W., Underkofler, H. A., Kamp, T. J., January, C. T., & Beebe, D. J. (2011). Microfluidic cell culture and its application in high-throughput drug screening: cardiotoxicity assay for hERG channels. Journal of biomolecular screening, 16(1), 101-111.
[2] An, D., Kim, K., & Kim, J. (2014). Microfluidic system based high throughput drug screening system for curcumin/TRAIL combinational chemotherapy in human prostate cancer PC3 cells. Biomolecules & therapeutics, 22(4), 355-362.
[3] Walker, G. M., Zeringue, H. C., & Beebe, D. J. (2004). Microenvironment design considerations for cellular scale studies. Lab on a Chip, 4(2), 91-97.
[4] Toepke, M. W., & Beebe, D. J. (2006). PDMS absorption of small molecules and consequences in microfluidic applications. Lab on a Chip, 6(12), 1484-1486.
[5] Su, X., Young, E. W., Underkofler, H. A., Kamp, T. J., January, C. T., & Beebe, D. J. (2011). Microfluidic cell culture and its application in high-throughput drug screening: cardiotoxicity assay for hERG channels. Journal of biomolecular screening, 16(1), 101-111.
[6] Mottet, G., Perez-Toralla, K., Tulukcuoglu, E., Bidard, F. C., Pierga, J. Y., Draskovic, I., … & Louis Viovy, J. (2014). A three dimensional thermoplastic microfluidic chip for robust cell capture and high resolution imaging. Biomicrofluidics, 8(2), 024109.
[7] Jena, R. K., & Yue, C. Y. (2012). Cyclic olefin copolymer based microfluidic devices for biochip applications: Ultraviolet surface grafting using 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine. Biomicrofluidics, 6(1), 012822.
[8] Nunes, P. S., Ohlsson, P. D., Ordeig, O., & Kutter, J. P. (2010). Cyclic olefin polymers: emerging materials for lab-on-a-chip applications. Microfluidics and nanofluidics, 9(2-3), 145-161.
[9] Johansson, B. L., Larsson, A., Ocklind, A., & Öhrlund, Å. (2002). Characterization of air plasma–treated polymer surfaces by ESCA and contact angle measurements for optimization of surface stability and cell growth. Journal of applied polymer science, 86(10), 2618-2625.
[10] Hong, T. F., Ju, W. J., Wu, M. C., Tai, C. H., Tsai, C. H., & Fu, L. M. (2010). Rapid prototyping of PMMA microfluidic chips utilizing a CO2 laser. Microfluidics and nanofluidics, 9(6), 1125-1133.
[11] Wei, C. W., Cheng, J. Y., & Young, T. H. (2006). Elucidating in vitro cell-cell interaction using a microfluidic coculture system. Biomedical microdevices, 8(1), 65-71.
[12] Ma, L., Zhou, C., Lin, B., & Li, W. (2010). A porous 3D cell culture micro device for cell migration study. Biomedical microdevices, 12(4), 753-760.
[13] Chang, C. W., Cheng, Y. J., Tu, M., Chen, Y. H., Peng, C. C., Liao, W. H., & Tung, Y. C. (2014). A polydimethylsiloxane–polycarbonate hybrid microfluidic device capable of generating perpendicular chemical and oxygen gradients for cell culture studies. Lab on a Chip, 14(19), 3762-3772.
[14] Piruska, A., Nikcevic, I., Lee, S. H., Ahn, C., Heineman, W. R., Limbach, P. A., & Seliskar, C. J. (2005). The autofluorescence of plastic materials and chips measured under laser irradiation. Lab on a Chip, 5(12), 1348-1354.
[15] Roy, E., Stewart, G., Mounier, M., Malic, L., Peytavi, R., Clime, L., … & Veres, T. (2015). From cellular lysis to microarray detection, an integrated thermoplastic elastomer (TPE) point of care Lab on a Disc. Lab on a Chip, 15(2), 406-416.
[16] Jellali, R., Paullier, P., Fleury, M. J., & Leclerc, E. (2016). Liver and kidney cells cultures in a new perfluoropolyether biochip. Sensors and Actuators B: Chemical, 229, 396-407.
[17] Jang, K., Sato, K., Igawa, K., Chung, U. I., & Kitamori, T. (2008). Development of an osteoblast-based 3D continuous-perfusion microfluidic system for drug screening. Analytical and bioanalytical chemistry, 390(3), 825-832.
[18] Corradini, E., Curti, P. S., Meniqueti, A. B., Martins, A. F., Rubira, A. F., & Muniz, E. C. (2014). Recent advances in food-packing, pharmaceutical and biomedical applications of zein and zein-based materials. International journal of molecular sciences, 15(12), 22438-22470.
