La coltura cellulare comprende tutte le tecniche di laboratorio che consentono la crescita delle cellule in un ambiente artificiale, in condizioni fisiologiche controllate. La ricerca in vitro è stata associata per decenni a monostrati 2D e a fiasche per coltura cellulare. Sebbene ciò abbia permesso progressi significativi in molti campi, dalla comprensione dei meccanismi cellulari allo sviluppo dei farmaci, presenta importanti limitazioni. La prima è che il nostro corpo non è organizzato in 2D. In risposta a queste limitazioni, gli scienziati hanno sviluppato approcci innovativi per coltivare le cellule in tre dimensioni. L'ultimo decennio ha portato la sua quota di innovazioni nelle biotecnologie per passare dalla coltura cellulare 2D a quella 3D, come le micropiastre per sferoidi o il bioprinting.
In questa sede analizzeremo cosa sia la coltura cellulare 3D e in che modo i suoi vantaggi e limiti possano influenzare molti campi della ricerca.
Sommario
Coltura cellulare 3D - Definizione e applicazione
La coltura cellulare 3D è stata definita come “una coltura cellulare in grado di imitare l'organizzazione e la microarchitettura di un organo vivente” (4. Huh et al., 2011). In altre parole, è la capacità di mantenere le cellule in spazi artificiali in cui possono crescere e interagire con il loro ambiente in tutte e tre le dimensioni. Ciò consente di simulare in modo più fedele l'ambiente reale, ovvero il corpo umano, degli organi studiati. Inoltre, questo ambiente artificiale può essere ottimizzato in termini di forma, materiale o persino composizione chimica per replicare tale ambiente in vivo nel modo più fisiologico possibile.
“Coltura cellulare 3D” è un termine generale utilizzato per descrivere diverse tecniche e metodi:
L'uso di scaffold, siano essi sintetici (realizzati ad esempio in ceramica o polimeri) o naturali come componenti extracellulari e idrogel per ricreare l'ambiente di un organo sia a livello meccanico che biologico;
Bioreattori, che consentono la coltivazione su larga scala di numerosi tipi di cellule, in un ambiente altamente controllato e con una regolazione precisa dei parametri di coltura;
Organ-on-chip, dotati di diverse camere/canali collegati per co-coltivare differenti tipi di cellulari, che hanno aperto la strada allo studio delle comunicazioni tra organi (cross-talk), delle funzioni secretorie e della coltivazione cellulare dinamica;
Organoidi, che replicano l'architettura 3D dei diversi tipi cellulari che compongono un organo, consentendo una migliore comprensione dello sviluppo e della rigenerazione degli organi, nonché lo studio dei tumori.
Bioprinting, che utilizza bioinks per ricreare strutture 3D, dagli scaffold agli organi.
Storicamente, la necessità di modelli in vitro 3D è cresciuta di pari passo con le limitazioni sull'uso degli animali nella ricerca e con la quantità di direttive nazionali e internazionali volte a sviluppare metodi non animali per la ricerca farmaceutica e cosmetica. Tali limitazioni derivano da motivazioni di carattere etico (sofferenza inflitta agli animali) e biologico (mancanza di trasferibilità dei dati dagli animali agli esseri umani).
La coltura cellulare 3D può essere impiegata in tutte le applicazioni della coltura 2D e persino oltre, poiché fornisce un ulteriore livello di complessità per acquisire una comprensione più approfondita del comportamento e dei meccanismi cellulari. Le applicazioni includono: la scoperta e il metabolismo dei farmaci, lo sviluppo tissutale, la ricerca sul cancro e molte altre.
Perché la coltura cellulare 3D è superiore a quella 2D?
Il desiderio e la necessità di implementare tecniche di coltura cellulare 3D in numerosi progetti di ricerca sono cresciuti negli ultimi anni a causa dei numerosi vantaggi associati a questa innovazione. La possibilità di crescere in tutte e tre le dimensioni e di interagire con un ambiente fisiologico comporta infatti notevoli implicazioni positive per le cellule rispetto alla crescita in 2D su una superficie di plastica rigida.
Nelle colture cellulari 3D:
- La morfologia cellulare è più naturale e somiglia maggiormente a quella dell'ambiente in vivo;
- La distribuzione cellulare è limitata stericamente e la proliferazione cellulare risulta rallentata rispetto al 2D, dove il tasso di proliferazione è notevolmente superiore a quello osservato in vivo;
- Viene stabilita una polarità cellulare naturale, che garantisce un comportamento cellulare più fisiologico.
- Vengono favorite interazioni cellula-cellula e cellula-matrice più realistiche, replicando in modo più fisiologico lo scambio di segnali meccanici, biologici e chimici.
- Anche l'accesso ai nutrienti, compreso l'ossigeno, risulta modificato e più realistico nelle colture tridimensionali, poiché le cellule sono esposte a gradienti spaziotemporali e non tutte ricevono la stessa quantità di ciascun nutriente nello stesso momento, contrariamente a quanto avviene in 2D.
In sintesi, le cellule coltivate in 3D presentano molte più somiglianze con le cellule in vivo in termini di struttura e, di conseguenza, di funzioni. È stato dimostrato che tutti i parametri sopra elencati sono importanti regolatori dei profili di espressione genica. Di conseguenza, grazie a un ambiente più fisiologico, le cellule dovrebbero mostrare un comportamento più affine a quello fisiologico rispetto alle colture cellulari 2D. Ci si aspetta che gli effetti osservati di farmaci e molecole su questi modelli siano più vicini a quanto accade nell'organismo, migliorando la capacità predittiva di efficacia e tossicità dei farmaci di nuova concezione e incrementando il successo della traslazione dagli studi preclinici a quelli clinici.
Quali sono le problematiche legate alle colture cellulari 3D?
Nonostante i numerosi vantaggi delle colture cellulari 3D discussi in precedenza, esse presentano anche alcune limitazioni che, sebbene superabili, è fondamentale tenere a mente quando si valuta il passaggio dalle colture 2D a quelle 3D.
- A causa della maggiore complessità intrinseca della struttura tridimensionale, l'allestimento di questi modelli richiede solitamente maggiore competenza, formazione e tecnicità. Può risultare inizialmente complesso e dispendioso in termini di tempo individuare tutti gli elementi e le condizioni sperimentali idonei, nonché adottare nuovi protocolli e tecniche.
- Al momento, trattandosi di un campo completamente nuovo, si registra una carenza globale di standardizzazione e di protocolli condivisi. Può risultare difficile reperire linee guida per i principianti e riuscire a riprodurre e confrontare agevolmente i risultati. La questione della standardizzazione è tuttavia al centro di numerosi dibattiti con i principali attori del settore.
- Nel complesso, i modelli 3D comportano costi superiori di allestimento e mantenimento. Tali modelli possono richiedere il passaggio a nuovi materiali di consumo per laboratorio, come idrogel, scaffold e supporti in plastica, ed eventualmente a nuove attrezzature, soprattutto per quanto riguarda l'imaging.
- L'imaging, infatti, può rivelarsi complesso poiché risulta più difficile visualizzare le cellule all'interno di una struttura tridimensionale rispetto a un monostrato. L'aggiunta di una dimensione nell'acquisizione delle immagini può pertanto richiedere competenze specifiche, formazione e un potenziale investimento in strumentazione adeguata.
- Rispetto ai classici palloni di coltura utilizzati nei sistemi 2D, che contengono milioni di cellule, lo scaling up dei modelli 3D di nuova concezione per studi su larga scala può rappresentare una sfida a causa della complessità dei modelli stessi e delle piattaforme attualmente disponibili.
In definitiva, la coltura cellulare 3D rappresenta la logica evoluzione successiva per tutti i ricercatori che cercano di decifrare i meccanismi alla base dello sviluppo d'organo, dei processi biologici, della patofisiologia delle malattie o dell'efficacia e tossicologia dei farmaci. Il settore è in rapida evoluzione e vengono continuamente sviluppate numerose tecnologie per supportare i ricercatori nella transizione verso i modelli 3D.
Fonti:
- Cacciamali A, Villa R, Dotti S. 3D Cell Cultures: Evolution of an Ancient Tool for New Applications. Front Physiol. 2022 Jul 22;13:836480. doi: 10.3389/fphys.2022.836480. PMID: 35936888; PMCID: PMC9353320.
- Jensen C, Teng Y. Is It Time to Start Transitioning From 2D to 3D Cell Culture? Front Mol Biosci. 2020 Mar 6;7:33. doi: 10.3389/fmolb.2020.00033. PMID: 32211418; PMCID: PMC7067892.
- https://www.upmbiomedicals.com/resource-center/learning-center/what-is-3d-cell-culture/2d-versus-3d-cell-culture/
- Huh D, Hamilton GA, Ingber DE. From 3D cell culture to organs-on-chips. Trends Cell Biol. 2011 Dec;21(12):745-54. doi: 10.1016/j.tcb.2011.09.005. Epub 2011 Oct 25. PMID: 22033488; PMCID: PMC4386065.
Colture cellulari di sferoidi e organoidi 3D: le principali differenze
[...] Nel panorama dinamico della ricerca biomedica, l'avvento delle colture cellulari tridimensionali (3D) ha rivoluzionato la nostra capacità di studiare sistemi biologici complessi al di fuori del corpo umano. A differenza delle tradizionali colture bidimensionali (2D), che semplificano eccessivamente le interazioni cellulari, le colture 3D come sferoidi e organoidi imitano con maggiore precisione la struttura e la funzione intricate di tessuti e organi. Questo progresso è fondamentale per ottenere una comprensione più approfondita dei processi biologici fondamentali, dei meccanismi patologici e delle risposte ai farmaci in un contesto biologicamente più rilevante. Nell'ultimo decennio, gli scienziati hanno sviluppato soluzioni innovative per coltivare cellule in 3D. [...]