La recherche de matériaux ultra-transparents pour fabriquer des puces microfluidiques n'est pas une coïncidence. L'ultra-transparence des matériaux se prête très bien à la microscopie, en particulier pour les applications biologiques. Dans cette brève revue, notre équipe d'experts présente un protocole simple pour la coloration des cellules dans les puces. Ce protocole fonctionne également très bien pour les sphéroïdes et les organoïdes.
On pourrait penser que pour colorer des cellules cultivées dans une puce microfluidique, il suffit de les colorer avant de les charger sur une puce. Cependant, ce n'est pas toujours possible lorsque le colorant à utiliser est toxique pour les cellules. D'autres fois, ce sont des cellules ou des tissus nouvellement formés que l'on souhaite colorer. Il est donc nécessaire de connaître les étapes clés qui vous permettront de réussir votre marquage cellulaire.
Une étape essentielle avant la phase de coloration est le changement de phase. Le changement de phase consiste à retirer la couche d'huile et de surfactant présente à la surface des gouttes afin d'apporter un autre fluide (médicament ou solution de coloration par exemple).
Protocole de changement de phase sur puce
Matériau
- Solution de 20% de PFO dans du HFE7500 pour déstabiliser le surfactant (Il est possible d'utiliser une solution de 50% de PFO dans du HFE7500 si l'huile dans la puce présente un pourcentage élevé de surfactant (>1%))
- Seringue à huile
- Mélangez la solution pour la coloration (voir la section suivante)
Perfusion avec de l'huile
OBJECTIF : diminuer la concentration en surfactant par dilution
- Déconnecter la sortie de la chambre
- Connecter la seringue d'huile en évitant les bulles d'air
- Déconnecter les entrées (chambre, jonction et cellules) et connecter le tube pour les sorties
- Injecter approximativement 500 µL d'huile (ou plus) (à débit moyen, c'est-à-dire environ 100 µL/min)
Perfusion de PFO 20% dans du HFE7500
OBJECTIF : déstabiliser le surfactant
- Retirez la seringue d'huile
- Connecter la seringue de PFO
- Injecter approximativement 300-400 µL de PFO (à débit moyen, c'est-à-dire environ 100 µL/min)
Perfusion de la phase aqueuse
Dans notre cas, il s'agira de solutions pour le marquage des cellules selon le protocole suivant.
Pour toutes les étapes de connexion et de déconnexion, l'équipe Darwin Microfluidics vous conseille l'utilisation de vannes et d'un piège à bulles d'air pour faciliter ce protocole. Vous pouvez trouver tous les produits Darwin Microfluidics juste ici.
Coloration des cellules cultivées dans une puce microfluidique
Matériau
- Solution de 4% de paraformaldéhyde (ou PFA) pour fixer les cellules
- Solution de Triton X-100 pour la perméabilisation des cellules (à 1% dans du PBS)
- 1 % de BSA dans 5 % de FBS dans une solution de PBS
- Solution saline tamponnée au phosphate (ou PBS) pour le lavage
- Solution de colorant ou d'anticorps pour la coloration des cellules
Fixation des cellules
OBJECTIF : Le PFA permet d'arrêter les réactions cellulaires et de maintenir leur état biologique (forme, cycle cellulaire, …)
- Connecter la seringue de PFA à 4% (environ 160 µl)
- Respecter 20 min d'incubation (une fois la perfusion terminée)
- Laver au PBS (environ 160 µl)
Perméabilisation des cellules
OBJECTIF : Augmenter la taille des pores de la membrane cellulaire afin de favoriser l'entrée des colorants. Le Triton x100 est un détergent capable d'attaquer les lipides de la membrane cellulaire
- Connecter la seringue de Triton 1% (environ 160 µl)
- Respecter 5 min d'incubation
- Laver au PBS (environ 160 µl)
Blocage des sites non spécifiques
OBJECTIF : La BSA (en solution FBS) se complexe avec les protéines afin de favoriser les interactions compétitives entre les protéines et les marqueurs
- Perfusion de 1% de BSA dans 5% de FBS dans du PBS (environ 160 µl)
- Incubation 60 min (non stricte)
- Laver au PBS (environ 160 µl)
Fixation de colorant
OBJECTIF : C'est la dernière étape de la coloration. Cette étape doit être réalisée dans l'obscurité !
Numerous markers are available on the market and can meet all your needs whatever your application. In this step we take as examples the most common markers.
> Anticorps I anti-cadherine E et anticorps II anti-chèvre [488] pour visualiser les jonctions cellule-cellule en vert (dilués dans une solution BSA-FBS)
> La phalloïdine est utilisée pour visualiser l'actine polymérisée en rouge (diluée dans une solution BSA-FBS)
- Perfusion d'anticorps I anti-cadherine E dilué à 1/1000 dans une solution BSA-FBS (environ 160 µl)
- Incubation 60 min
- Laver au PBS (environ 160 µl)
- Perfusion d'anticorps II anti-chèvre [488] dilué à 1/1000 dans une solution BSA-FBS (environ 160 µl)
- Incubation 60 min
- Laver au PBS (environ 160 µl)
- Perfusion de Phalloïdine diluée à 1/2000 dans une solution BSA-FBS (environ 160 µl)
- Incubation 30 min
- Laver au PBS (environ 160 µl)
Il est à noter que les dilutions sont effectuées conformément au protocole du fournisseur.
Pour manipuler facilement vos solutions, les experts de Darwin Microfluidics vous conseillent d'utiliser des racks de réservoirs et des réservoirs microfluidiques pour tubes eppendorf. Retrouvez la gamme complète de réservoirs de Darwin Microfluidics juste ici.
