Organ-on-chip voor onderzoek naar de bloed-hersenbarrière

Door de principes van microfluïdica, microfabricage en celkweektechnieken te combineren, is een nieuwe generatie laboratoriumplatforms ontstaan, bekend onder de naam „organ-on-chip”. Organ-on-chip-systemen zijn microfluïdische apparaten die levende cellen bevatten. Deze microfluïdische apparaten kunnen micro-omgevingen beter nabootsen dan eerdere in-vitro-modellen. Microfluïdische apparaten zijn bijzonder geschikt voor het modelleren van biologische barrières, zoals de bloed-hersenbarrière, omdat ze de bloedstroom kunnen simuleren.

Opbouw en werking van de bloed-hersenbarrière

De bloed-hersenbarrière (BBB) is de grenslaag van cellen die de microvaten in de hersenen bekleedt en het bloed scheidt van de interstitiële vloeistoffen in de hersenen. De belangrijkste functie van de bloed-hersenbarrière is om als fysieke en metabolische barrière te fungeren door selectief transport van voedingsstoffen toe te laten, maar te voorkomen dat giftige stoffen uit het bloed de hersenen binnendringen.

De BBB bestaat uit gespecialiseerde endotheelcellen die worden omgeven door een basismembraan en vier andere celtypen: astrocyten, pericyten, neuronen en microglia. Deze vijf celtypen vormen samen met het basismembraan de neurovasculaire eenheid (figuur 1) [1]. Tussen aangrenzende endotheelcellen van de BBB worden afdichtende eiwitcomplexen gevormd, zogenaamde tight junctions. Hierdoor worden de cellen dicht tegen elkaar gehouden, waardoor de intracellulaire ruimtes worden afgesloten en paracellulair transport wordt voorkomen. Deze hoge barrièredichtheid is kenmerkend voor de BBB en cruciaal voor het handhaven van de homeostase in de hersenen. Een lokale verstoring van de barrière-integriteit, die leidt tot lekkage door de barrière heen, wordt in verband gebracht met verschillende aandoeningen van het centrale zenuwstelsel (CZS) [2]. Inzicht in de BBB en het omzeilen ervan is essentieel voor de behandeling van aandoeningen van het CZS. Systemen voor medicijnafgifte die de barrière tijdelijk kunnen openen, waardoor medicatie erdoorheen kan dringen en de hersenen kan bereiken, vormen een belangrijk onderzoeksgebied voor de behandeling van CZS-aandoeningen.

In-vitro-modellen van de bloed-hersenbarrière

In kunstmatige omgevingen kunnen de omstandigheden nauwkeurig worden geregeld en kan specifiek gedrag onafhankelijk worden bestudeerd, met minimale invloed van andere factoren. Van oudsher werd de BBB in vitro gereconstrueerd als statische modellen met behulp van conventionele celkweekopstellingen. Microfluïdische ‘organ-on-chip’-apparaten bieden oplossingen voor veel van de tekortkomingen van eerdere in-vitro-modellen. Deze apparaten kunnen worden ontworpen met realistischere architecturen en hun kleine afmetingen geven de geometrie van de capillairen in de neurovasculaire eenheid beter weer. Bovendien kunnen de modellen, door gebruik te maken van microfluïdica in plaats van experimenten in een bulkoplossing uit te voeren, fysiologische verschijnselen weergeven, zoals vloeistofstromen en schuifspanningen. Een ander voordeel van BBB-on-chip-modellen is dat sensoren voor realtime monitoring kunnen worden geïntegreerd [3].

Bloed-hersenbarrière op een microfluïdische chip

Hieronder worden twee van de eerste microfluïdische apparaten besproken die baanbrekend werk hebben verricht bij de ontwikkeling van BBB-on-chip en die het principe van verschillende veelbelovende concepten hebben aangetoond. Ook worden enkele belangrijke ontwerpaspecten en validatieparameters besproken waarmee rekening moet worden gehouden bij de ontwikkeling van een organ-on-chip-apparaat voor onderzoek naar de BBB. Tegenwoordig zijn kant-en-klare chips voor organ-on-chip-toepassingen in de handel verkrijgbaar of kunnen ze op maat worden besteld.

Voor zover wij weten, waren Booth et al. de eersten die in 2012 een on-chipmodel van de bloed-hersenbarrière publiceerden [4], gevolgd door een vervolgartikel in 2014 [5]. Hun apparaat, weergegeven in figuur 2, bestaat uit twee elkaar kruisende kanalen in lagen PDMS, met een diepte van 200 µm en een breedte van respectievelijk 2 mm en 5 mm. De twee kanalen werden gescheiden door een poreus polycarbonaatmembraan bedekt met fibronectine. De kanaallagen werden afgedekt met glasplaatjes met dunnefilm-Ag/AgCl-elektroden met een vierpunts-meetstructuur die over het membraan was geplaatst. Endotheelcellen van de muis (b.End3) en astrocyten van de muis (C8D1A) werden aan weerszijden van het membraan in cocultuur gekweekt. In beide kanalen werd een stroomsnelheid van 2,6 mL/min toegepast, wat volgens berekeningen in het artikel overeenkwam met een schuifspanning van 2 mPa op de endotheelcellen. De transendotheliale elektrische weerstand (TEER) werd gemeten tot 180–280 Vcm² met de geïntegreerde dunne-film-elektroden. Verder werd het tight-junction-eiwit ZO-1 geïdentificeerd met immunofluorescentie, en werden permeabiliteitsstudies uitgevoerd om de barrièrefunctie te bevestigen.

Een ander volledig geïntegreerd BBB-apparaat werd in 2013 door Griep et al. gepubliceerd [6]. Het apparaat bestond uit twee lagen PDMS met kanalen van 500 µm breed en 100 µm diep, met daartussen een met collageen gecoat polycarbonaatmembraan. Op het membraan werden menselijke microvasculaire endotheelcellen uit de hersenen (hCMEC/D3) gekweekt. Ze gebruikten vier platinadraden om de TEER-waarde gedurende 7 dagen te monitoren aan de hand van impedantiespectroscopiemetingen. Ze verkregen een gemiddelde TEER-waarde van 28 Vcm² ± 1,3 SEM. Ze constateerden een toename van de TEER tot 120 Vcm² bij een stroomsnelheid van 2,5 mL/h, wat overeenkomt met een berekende schuifspanning van 0,58 Pa.

Chipmateriaal voor organ-on-chip

PDMS wordt op grote schaal gebruikt voor de vervaardiging van ‘organ-on-chip’-apparaten. Enkele voordelen van PDMS zijn onder meer dat het biocompatibel en transparant is (240 nm – 1100 nm), goedkoop en gemakkelijk te verwerken is, met hoge resolutie kan worden gegoten en kan worden verlijmd aan glas of PDMS [7]. Het is echter zeer hydrofoob, wat problematisch kan zijn bij het vullen van de kanalen of het verkrijgen van een hechte hechting voor lekvrije chips. Bovendien is het moeilijk om elektroden op het oppervlak van PDMS aan te brengen, en daarom wordt vaak glas gebruikt in apparaten met gepatroneerde dunne-filmelektroden.

Cellen in modellen van de bloed-hersenbarrière op een chip

Het type cellen dat wordt gebruikt, is van groot belang voor het opzetten van biologisch relevante modellen. Het is echter nog onduidelijk hoe de verschillende cellen van de neurovasculaire eenheid precies bijdragen aan de barrièrefunctie [8]. Om de menselijke bloed-hersenbarrière na te bootsen, zou het gebruik van menselijke cellen uiteraard de meest voorspellende methode zijn. Menselijke capillaire endotheelcellen uit de hersenen zijn uitgebreid gekarakteriseerd, maar zijn moeilijk verkrijgbaar en moeilijk reproduceerbaar [1]. Recente ontwikkelingen op het gebied van het afleiden van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC) bieden veelbelovende mogelijkheden om dergelijke moeilijkheden te overwinnen [9].

Het samen kweken van endotheelcellen met andere cellen uit de neurovasculaire eenheid zal naar verwachting een fysiologisch relevantere weergave opleveren, aangezien deze cellen eveneens van invloed zijn op de vorming en instandhouding van de barrière [10]. Er zijn al verschillende studies gepubliceerd over co-culturen in microfluïdische BBB-modellen, voornamelijk met endotheelcellen en astrocyten [4] [11], maar ook met neuronen [12] en pericyten. Astrocyten en endotheelcellen staan niet in direct contact met elkaar, maar worden gescheiden door de basale lamina. In microfluïdische systemen kunnen ze aan weerszijden van het membraan worden gekweekt. Als het membraan in het systeem echter te dik is, zal het cel-celcontact beperkt zijn. Om de 3D-omgeving van de extracellulaire matrix na te bootsen, zijn hydrogels gebruikt als scaffolds voor het zaaien van cellen in microfluïdische kamers [12].

Afschuifspanning op endotheelcellen

De endotheelcellen van de bloed-hersenbarrière (BBB) in de neurovasculaire eenheid worden blootgesteld aan een kracht loodrecht op de vaatwand als gevolg van de bloeddruk, evenals aan schuifspanning die voortkomt uit de bloedstroom, in de richting van de stroming. Er is al eerder gemeld dat schuifspanningen de morfologie en functie van endotheelcellen beïnvloeden en een positief effect hebben op de barrièrevorming [13]. Organ-on-chip-apparaten hebben het grote voordeel dat ze, in tegenstelling tot andere soorten apparaten, geschikt zijn voor het integreren van vloeistofstroming. Levende bloedvaten hebben een cirkelvormige dwarsdoorsnede, terwijl microfluïdische apparaten doorgaans een rechthoekige dwarsdoorsnede hebben. In een buis met een cirkelvormige dwarsdoorsnede zal de schuifspanning gelijkmatig en uniform over de wanden verdeeld zijn vanwege de cilindrische symmetrie. Bij een rechthoekige dwarsdoorsnede is de schuifspanning echter niet uniform. Om de meest uniforme spanning in een rechthoekige dwarsdoorsnede te bereiken, kan een zo vlak mogelijk stromingsprofiel worden verkregen door de kanalen zo te ontwerpen dat de kanaalhoogte veel kleiner is dan de kanaalbreedte [14]. De fysiologische schuifspanning voor hersencapillairen bedraagt 0,3-2 Pa [2].

Transendotheliale elektrische weerstand (TEER)

TEER beschrijft de weerstand over een celbarrière en wordt vaak gebruikt als validatieparameter om te controleren of endotheelcellen in BBB-modellen ‘tight junction’-complexen vormen [15]. Als de endotheelcellen zich op de juiste manier ontwikkelen en ‘tight junctions’ vormen met aangrenzende cellen, worden de intercellulaire ruimtes van de cellaag afgesloten en wordt de stroomdoorvoer beperkt [16]. Dit leidt tot een hogere stroomweerstand, wat tot uiting komt in hogere TEER-waarden. TEER wordt vaak uitgedrukt als een genormaliseerde waarde ten opzichte van het membraanoppervlak in de eenheid^Ωcm², zoals hieronder weergegeven, om een directe vergelijking met andere modellen te vergemakkelijken.

𝑇𝐸𝐸𝑅 (Ω^𝑐𝑚²) = 𝑅𝑒𝑠𝑖𝑠𝑡𝑎𝑛𝑐𝑒 (Ω) × 𝐶𝑒𝑙𝑙 𝑐𝑢𝑙𝑡𝑢𝑟𝑒 𝑎𝑟𝑒𝑎 (^𝑐𝑚²)

In BBB-on-chip-modellen is het meten van de TEER een snelle, niet-invasieve methode waarmee de kwaliteit van de barrière in realtime kan worden beoordeeld. De metingen worden uitgevoerd door een lage elektrische stroom over de cellaag te leiden en tegelijkertijd te meten in hoeverre de stroom door de cellaag wordt belemmerd. Organ-on-chip-apparaten zijn geschikt voor het integreren van sensoren waarmee de TEER in realtime kan worden gemonitord, wat bij andere soorten apparaten moeilijk is. In-vitro-modellenvan de BBB moeten TEER-waarden van meer dan 150-200^Ωcm²bereiken om als aanvaardbare modellen te worden beschouwd [19]. Dit is ongeveer een factor tien lager dan de gerapporteerdein-vivo-resultaten. De reden waarom een veel lagere TEER wordt geaccepteerd, is te wijten aan de vereenvoudigde omstandighedenin vitro.

Doorlaatbaarheid van modellen van de bloed-hersenbarrière op een chip

Organ-on-chip-modellen kunnen rechtstreeks informatie verschaffen over de barrièrefunctie door de permeabiliteit van de barrière voor verschillende stoffen te testen. Het is nuttig om de permeabiliteit zodanig te kwantificeren dat deze gemakkelijk kan worden vergeleken met in vivo-gegevens. Passief transport door de barrière kan worden gekwantificeerd aan de hand van de permeabiliteitscoëfficiënt van een analyt die door de chip stroomt. Er moet worden opgemerkt dat ook andere factoren dan diffusie kunnen bijdragen aan het transport, zoals convectieve stroming als er openingen in de celbarrière zitten, en osmotische stroming als gevolg van verschillen in de concentraties van opgeloste stoffen tussen de kanalen. Dit kan worden voorkomen door de concentratie van de opgeloste stoffen in de kanalen te regelen en tijdens de experimenten in beide kanalen dezelfde druk te handhaven. Aangezien het transport van hydrofiele verbindingen door de barrière zeer beperkt is, worden deze verbindingen, gemerkt met fluorescerende tracers, vaak gebruikt voor permeabiliteitsonderzoeken. De permeabiliteit kan vervolgens worden gevisualiseerd met een fluorescentiemicroscoop.

Geschreven door Emma Thomée, promovendus bij het MAMI-project, met financiële steun van het onderzoeks- en innovatieprogramma Horizon 2020 van de Europese Unie in het kader van subsidieovereenkomst nr. 766007.

Literatuurlijst

Abbott, N.J., e.a.,Structuur en functie van de bloed-hersenbarrière.Neurobiol Dis, 2010.37(1): blz. 13-25.
Wong, A.D., e.a.,De bloed-hersenbarrière: een technisch perspectief.Front Neuroeng, 2013.6: p. 7.
Bhatia, S.N. en D.E. Ingber,„Microfluïdische ‘organs-on-chips’”.Nat Biotechnol, 2014.32(8): blz. 760-72.
Booth, R. en H. Kim,Karakterisering van een microfluïdisch in-vitro-model van de bloed-hersenbarrière ([small mu ]BBB).Lab on a Chip, 2012.12(10): p. 1784-1792.
Booth, R. en H. Kim,Permeabiliteitsanalyse van neuroactieve geneesmiddelen via een dynamisch microfluïdisch in-vitro-model van de bloed-hersenbarrière.Ann Biomed Eng, 2014.42(12): p. 2379-91.
Griep, L.M., e.a.,BBB on chip: microfluïdisch platform voor het mechanisch en biochemisch beïnvloeden van de functie van de bloed-hersenbarrière.Biomed Microdevices, 2013.15(1): p. 145-50.
Sia, S.K. en G.M. Whitesides,Microfluïdische apparaten vervaardigd uit poly(dimethylsiloxaan) voor biologisch onderzoek.Electrophoresis, 2003.24(21): p. 3563-76.
Hawkins, B.T. en T.P. Davis,„De bloed-hersenbarrière/neurovasculaire eenheid bij gezondheid en ziekte”.Pharmacological Reviews, 2005.57(2): p. 173.
Pamies, D., T. Hartung en H.T. Hogberg,„Biologische en medische toepassingen van een ‘brain-on-a-chip’”.Experimental Biology and Medicine, 2014.239(9): blz. 1096-1107.
Serlin, Y., e.a.,Anatomie en fysiologie van de bloed-hersenbarrière.Seminars in cell & developmental biology, 2015.38: blz. 2-6.
Bang, S., et al.,Een microfluïdisch platform voor de bloed-hersenbarrière met lage permeabiliteit en direct contact tussen het doorbloedbare vaatnetwerk en astrocyten.Scientific Reports, 2017.7(1): p. 8083.
Adriani, G., e.a.,Een 3D-neurovasculair microfluïdisch model bestaande uit neuronen, astrocyten en cerebrale endotheelcellen als bloed-hersenbarrière.Lab On A Chip, 2017.17(3): p. 448-459.
Dewey, C.F., e.a.,De dynamische reactie van vasculaire endotheelcellen op vloeistofschuifspanning.J Biomech Eng, 1981.103(3): p. 177-85.
van der Helm, M.W., e.a.,Microfluïdische ‘organ-on-chip’-technologie voor onderzoek naar de bloed-hersenbarrière.Tissue Barriers, 2016.4(1): p. e1142493.
Srinivasan, B., e.a.,TEER-meettechnieken voor in-vitro-barrièremodellen.J Lab Autom, 2015.20(2): p. 107-26.
Thuenauer, R., E. Rodriguez-Boulan en W. Römer,„Microfluïdische benaderingen voor de kweek en karakterisering van epitheelcellaagjes”.Analyst, 2014.139(13): p. 3206-18.
Benson, K., S. Cramer en H.J. Galla,„Impedantiegebaseerde celmonitoring: barrière-eigenschappen en meer”.Fluids Barriers CNS, 2013.10(1): p. 5.
Wegener, J. en J. Seebach,Experimentele methoden voor het volgen van de dynamiek van de endotheliale barrièrefunctie: een overzicht van in-vitrobenaderingen.Cell Tissue Res, 2014.355(3): p. 485-514.
Reichel, A., D.J. Begley en N.J. Abbott,„Een overzicht van in-vitrotechnieken voor onderzoek naar de bloed-hersenbarrière”.Methods Mol Med, 2003.89: p. 307-24.