De zoektocht naar uiterst transparant materiaal voor de productie van microfluïdische chips is geen toeval. De uiterst hoge transparantie van deze materialen leent zich uitstekend voor microscopisch onderzoek, met name voor biologische toepassingen. In dit korte overzicht presenteert ons team van deskundigen een eenvoudig protocol voor het kleuren van cellen in chips. Dit protocol werkt ook uitstekend voor sferoïden en organoïden.
Je zou kunnen denken dat je, om cellen die in een microfluïdische chip worden gekweekt te kleuren, ze alleen maar hoeft te kleuren voordat ze op de chip worden aangebracht. Dit is echter niet altijd mogelijk wanneer de te gebruiken kleurstof giftig is voor de cellen. In andere gevallen wil je juist pas gevormde cellen of weefsel kleuren. Het is daarom noodzakelijk om de belangrijkste stappen te kennen waarmee je je cellen succesvol kunt markeren.
Een essentiële stap voorafgaand aan de kleuringsfase is de faseverandering. De faseverandering bestaat uit het verwijderen van de laag olie en oppervlakte-actieve stof die zich op het oppervlak van de druppels bevindt, om zo ruimte te maken voor een andere vloeistof (bijvoorbeeld een geneesmiddel of een kleuringsoplossing).
Protocol voor faseverandering op de chip
Materiaal
- 20% PFO in een HFE7500-oplossing om de oppervlakteactieve stof te destabiliseren (het is mogelijk om een 50% PFO-oplossing in HFE7500 te gebruiken als de olie in de chip een hoog gehalte aan oppervlakteactieve stof bevat (>1%))
- Olie-injectiespuit
- Meng de oplossing voor het kleuren (zie het volgende hoofdstuk)
Perfusie met olie
DOEL: de concentratie van het oppervlakteactieve middel verlagen door verdunning
- Koppel de uitlaat van de kamer los
- Sluit de oliespuit aan en zorg ervoor dat er geen luchtbellen ontstaan
- Koppel de inlaten (kamer, verbindingsstuk en cellen) los en sluit de uitlaten a tube
- Injecteer ongeveer 500 µL olie (of meer) (bij een gemiddelde stroomsnelheid, d.w.z. ongeveer 100 µL/min)
Perfusie van PFO 20% in HFE7500
DOEL: de oppervlakteactieve stof destabiliseren
- Verwijder de oliespuit
- Sluit de PFO-spuit aan
- Injecteer ongeveer 300-400 µL PFO (bij een gemiddelde stroomsnelheid, d.w.z. ongeveer 100 µL/min)
Perfusie van de waterige fase
In ons geval gaat het om oplossingen voor het markeren van de cellen volgens het volgende protocol.
Voor alle fasen van het aansluiten en loskoppelen raadt het team van Darwin Microfluidics u aan om afsluiters en een luchtbelafscheider te gebruiken om dit protocol te vergemakkelijken. U vindt alle producten van Darwin Microfluidics hier.
Kleuring van cellen die in een microfluïdische chip zijn gekweekt
Materiaal
- 4% paraformaldehyde (of PFA)-oplossing om cellen te fixeren
- Triton x100-oplossing voor het permeabiliseren van cellen (1% in PBS)
- 1% BSA in 5% FBS in een PBS-oplossing
- Fosfaatgebufferde zoutoplossing (of PBS) voor het wassen
- Oplossing met kleurstof of antilichamen om cellen te kleuren
Fixatie van cellen
DOEL: Met PFA kunnen celreacties worden gestopt en blijft de biologische toestand van de cellen behouden (vorm, celcyclus, …)
- Sluit de spuit met 4% PFA aan (ongeveer 160 µl)
- Laat het 20 minuten intrekken (nadat de infusie is voltooid)
- Was met PBS (ongeveer 160 µl)
Permeabilisatie van cellen
DOEL: De poriëngrootte van het celmembraan vergroten om de opname van kleurstoffen te bevorderen. Triton X-100 is een detergens dat de lipiden van het celmembraan kan aantasten
- Sluit de Triton 1%-spuit aan (ongeveer 160 µl)
- Laat het 5 minuten inwerken
- Was met PBS (ongeveer 160 µl)
Blokkering van niet-specifieke plaatsen
DOEL: De BSA (in FBS-oplossing) vormt complexen met eiwitten om competitieve interacties tussen eiwitten en markers te bevorderen
- Perfusie met 1% BSA in 5% FBS in PBS (ongeveer 160 µl)
- Incubatietijd 60 min (niet strikt)
- Was met PBS (ongeveer 160 µl)
Kleurstoffixatie
DOEL: Dit is de laatste stap van het kleuren. Deze stap moet in het donker worden uitgevoerd!
Er zijn talrijke markeerstiften op de markt verkrijgbaar die aan al uw behoeften kunnen voldoen, ongeacht de toepassing. In deze stap nemen we de meest gangbare markeerstiften als voorbeeld.
> Antilichaam I tegen cadherine E en antilichaam II tegen geit [488] om cel-celverbindingen in het groen weer te geven (verdund in een BSA-FBS-oplossing)
> Falloidine wordt gebruikt om het gepolymeriseerde actine rood te kleuren (verdund in een BSA-FBS-oplossing)
- Perfusie met antilichaam I (anti-cadherine E), verdund in een verhouding van 1:1000 in een BSA-FBS-oplossing (ongeveer 160 µl)
- Incubatie: 60 min
- Was met PBS (ongeveer 160 µl)
- Perfusie met antilichaam II anti-geit [488], verdund in een verhouding van 1:1000 in een BSA-FBS-oplossing (ongeveer 160 µl)
- Incubatie: 60 min
- Was met PBS (ongeveer 160 µl)
- Perfusie met falloidine, verdund in een verhouding van 1:2000 in een BSA-FBS-oplossing (ongeveer 160 µl)
- Incubatie: 30 min
- Was met PBS (ongeveer 160 µl)
Houd er rekening mee dat verdunningen worden uitgevoerd volgens het protocol van de leverancier.
Om uw oplossingen gemakkelijk te kunnen verwerken, raden de experts van Darwin Microfluidics u aan om tankrekken en microfluïdische reservoirs voor Eppendorf-buisjes te gebruiken. Bekijkhier het volledige assortiment tanks en reservoirs van Darwin Microfluidics .
