Organ-on-a-chip per la ricerca sulla barriera emato-encefalica

Combinando i principi della microfluidica, della microfabbricazione e delle tecniche di coltura cellulare, è emersa una nuova generazione di piattaforme di laboratorio, nota come "organ-on-chip". I sistemi organ-on-chip sono dispositivi microfluidici contenenti cellule vive. Questi dispositivi microfluidici sono in grado di ricreare i microambienti in modo più fedele rispetto ai precedenti modelli in vitro. I dispositivi microfluidici sono particolarmente adatti per modellare barriere biologiche, come la barriera emato-encefalica, poiché consentono di simulare il flusso sanguigno.

Struttura e funzione della barriera emato-encefalica

La barriera emato-encefalica (BBB) è lo strato cellulare di confine che riveste i microvasi cerebrali e separa il sangue dai fluidi interstiziali del cervello. La funzione principale della barriera emato-encefalica è quella di fungere da barriera fisica e metabolica, consentendo il trasporto selettivo dei nutrienti e impedendo alle sostanze tossiche presenti nel sangue di penetrare nel cervello.

La BBB è composta da cellule endoteliali specializzate circondate da una membrana basale e da altri quattro tipi di cellule: astrociti, periciti, neuroni e microglia. Questi cinque tipi di cellule e la membrana basale costituiscono insieme l'unità neurovascolare (figura 1) [1]. Complessi proteici sigillanti chiamati giunzioni strette (tight junctions) si formano tra le cellule endoteliali adiacenti della BBB. Di conseguenza, le cellule sono tenute a stretta vicinanza tra loro, occludendo così gli spazi intercellulari e prevenendo il trasporto paracellulare. Questa elevata tenuta della barriera è caratteristica della BBB ed è fondamentale per mantenere l'omeostasi cerebrale. Una localizzata alterazione della tenuta della barriera, che provoca una perdita (leakage) attraverso di essa, è associata a diverse malattie del sistema nervoso centrale (SNC) [2]. Comprendere e superare la BBB è essenziale per il trattamento delle patologie del SNC. I sistemi di rilascio dei farmaci (drug delivery systems) in grado di aprire temporaneamente la barriera, consentendo ai medicinali di passare e raggiungere il cervello, rappresentano un'area di ricerca chiave per il trattamento delle malattie del SNC.

Modelli in vitro della barriera emato-encefalica

Negli ambienti artificiali, le condizioni possono essere mantenute sotto stretto controllo ed è possibile studiare comportamenti specifici in modo indipendente con interferenze minime da parte di altri fattori. Tradizionalmente, la BBB è stata ricostruita in vitro come modello statico utilizzando configurazioni di coltura cellulare convenzionali. I dispositivi microfluidici organ-on-chip offrono soluzioni a molti dei limiti dei precedenti modelli in vitro. Questi dispositivi possono essere progettati con architetture più realistiche e le loro ridotte dimensioni rappresentano meglio la geometria dei capillari nell'unità neurovascolare. Inoltre, impiegando la microfluidica anziché condurre esperimenti in una soluzione di volume (bulk solution), i modelli possono mostrare fenomeni fisiologici come flussi di fluidi e tensioni di taglio (shear stresses). Un altro vantaggio dei modelli di BBB-on-chip è la possibilità di integrare sensori per il monitoraggio in tempo reale [3].

Barriera emato-encefalica su chip microfluidico

Di seguito vengono presentati due dei primi dispositivi microfluidici che hanno fatto da pionieri nello sviluppo del BBB-on-chip e fornito la prova di principio (proof-of-principle) per diversi concetti promettenti. Verranno inoltre introdotti alcuni importanti aspetti di progettazione e parametri di validazione da considerare durante lo sviluppo di un dispositivo organ-on-chip per lo studio della BBB. Oggi, i chip pronti all'uso per applicazioni organ-on-chip sono disponibili in commercio o possono essere ordinati su misura.

Per quanto ci risulta, Booth e collaboratori sono stati i primi a pubblicare un modello di BBB su chip nel 2012 [4], seguito da un ulteriore articolo nel 2014 [5]. Il loro dispositivo, mostrato nella figura 2, comprende due canali incrociati in strati di PDMS, con una profondità di 200 µm e una larghezza rispettivamente di 2 mm e 5 mm. I due canali erano separati da una membrana di policarbonato poroso rivestita di fibronectina. Gli strati dei canali erano coperti da vetrini con elettrodi a film sottile in Ag/AgCl con una struttura di rilevamento a quattro punti posizionata sopra la membrana. Cellule endoteliali di topo (b.End3) e astrociti murini (C8D1A) sono stati co-coltivati sui lati opposti della membrana. È stata applicata una portata (flow rate) di 2,6 mL/min in entrambi i canali, che secondo i calcoli presentati nell'articolo corrispondeva a una tensione di taglio di 2 mPa sulle cellule endoteliali. La resistenza elettrica transendoteliale (TEER) è stata misurata tra 180 e 280 Vcm2 utilizzando gli elettrodi a film sottile integrati. Inoltre, la proteina di giunzione stretta ZO-1 è stata identificata mediante immunofluorescenza e sono stati condotti studi di permeabilità per confermare la funzione di barriera.

Un altro dispositivo BBB completamente integrato è stato pubblicato da Griep et al. nel 2013 [6]. Il dispositivo era costituito da due strati di PDMS comprendenti canali con una larghezza di 500 µm e una profondità di 100 µm, con interposta una membrana in policarbonato rivestita di collagene. Cellule endoteliali microvascolari cerebrali umane (hCMEC/D3) sono state coltivate sulla sommità della membrana. Sono stati impiegati quattro fili di platino per monitorare il valore di TEER per un periodo di 7 giorni mediante misurazioni di spettroscopia d'impedenza. È stato ottenuto un valore medio di TEER pari a 28 Vcm2 ± 1,3 SEM). È stato osservato un incremento del TEER, fino a 120 Vcm2, applicando una portata di 2,5 mL/h, corrispondente a uno sforzo di taglio calcolato di 0,58 Pa.

Materiale del chip per organ-on-chip

Il PDMS è stato ampiamente utilizzato per la fabbricazione di dispositivi organ-on-chip. Tra i vantaggi del PDMS vi sono la biocompatibilità e la trasparenza (240 nm – 1100 nm), il costo contenuto e la facilità di manipolazione, la possibilità di essere stampato ad alta risoluzione e la capacità di legarsi al vetro o al PDMS [7]. Tuttavia, esso risulta fortemente idrofobico, il che può rappresentare un problema durante il riempimento dei canali o nell'ottenimento di un'adesione ermetica per evitare perdite nei chip. Inoltre, il deposito di elettrodi sulla superficie del PDMS risulta difficoltoso; pertanto, nei dispositivi dotati di elettrodi a film sottile strutturati viene spesso impiegato il vetro.

Cellule nei modelli di barriera emato-encefalica su chip

Il tipo di cellule impiegato riveste un'importanza fondamentale per la costruzione di modelli biologicamente rilevanti. Ciononostante, non è ancora del tutto chiaro in che modo le diverse cellule dell'unità neurovascolare contribuiscano alla funzione di barriera [8]. Per mimare la BBB umana, l'utilizzo di cellule umane rappresenterebbe ovviamente l'approccio a maggiore potere predittivo. Le cellule endoteliali dei capillari cerebrali umani sono state ampiamente caratterizzate, ma presentano una bassa disponibilità e riproducibilità [1]. Recenti progressi nella derivazione di cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC) offrono grandi prospettive per superare tali criticità [9].

La co-coltura di cellule endoteliali con altri tipi cellulari dell'unità neurovascolare promette di fornire una rappresentazione fisiologicamente più rilevante, poiché tali cellule influenzano anche la formazione e il mantenimento della barriera [10]. Numerosi studi su co-colture in modelli microfluidici di BBB sono già stati pubblicati, riguardanti principalmente cellule endoteliali con astrociti [4] [11], ma anche con neuroni [12] e periciti. Gli astrociti e le cellule endoteliali non sono in contatto diretto tra loro, bensì separati dalla lamina basale. All'interno dei dispositivi microfluidici, possono essere coltivati su lati opposti della membrana. Tuttavia, se lo spessore della membrana nel dispositivo risulta eccessivo, il contatto cellula-cellula sarà limitato. Per mimare l'ambiente tridimensionale della matrice extracellulare, sono stati impiegati idrogel come supporti (scaffold) per la semina cellulare all'interno delle camere microfluidiche [12].

Sforzo di taglio sulle cellule endoteliali

Le cellule endoteliali della BBB nell'unità neurovascolare sono sottoposte a una forza normale rispetto alla parete del vaso a causa della pressione sanguigna, nonché a uno sforzo di taglio (shear stress) generato dal flusso sanguigno, nella direzione del flusso stesso. È già stato documentato che gli sforzi di taglio influenzano la morfologia e la funzione delle cellule endoteliali, esercitando un effetto positivo sulla formazione della barriera [13]. I dispositivi organ-on-chip offrono il grande vantaggio di ben si prestare all'incorporazione del flusso di fluidi, a differenza di altre tipologie di dispositivi. I vasi sanguigni viventi presentano sezioni trasversali circolari, mentre i dispositivi microfluidici possiedono tipicamente sezioni trasversali rettangolari. In un tubo a sezione circolare, lo sforzo di taglio risulterà uniforme e costante sulle pareti a causa della simmetria cilindrica. Nel caso di una sezione rettangolare, invece, lo sforzo di taglio non sarà uniforme. Per ottenere lo sforzo più uniforme possibile in una sezione rettangolare, è possibile realizzare un profilo di flusso quanto più piatto possibile progettando canali in cui l'altezza sia notevolmente inferiore alla larghezza [14]. Lo sforzo di taglio fisiologico per i capillari cerebrali è pari a 0,3-2 Pa [2].

Resistenza elettrica transendoteliale (TEER)

Il TEER descrive la resistenza attraverso una barriera cellulare e viene spesso utilizzato come parametro di validazione per verificare se le cellule endoteliali nei modelli di BBB formano complessi di giunzioni strette (tight junctions) [15]. Se le cellule endoteliali proliferano correttamente e formano giunzioni strette con le cellule adiacenti, gli spazi intercellulari dello strato cellulare risultano occlusi, limitando il passaggio di corrente [16]. Ciò induce una maggiore resistenza al passaggio della corrente, che si riflette in valori di TEER più elevati. Il TEER viene spesso espresso normalizzandolo all'area della membrana nell'unità Ωcm², come illustrato di seguito, per agevolare il confronto diretto con altri modelli.

𝑇𝐸𝐸𝑅 (Ω 𝑐𝑚²) = 𝑅𝑒𝑠𝑖𝑠𝑡𝑎𝑛𝑐𝑒 (Ω) × 𝐶𝑒𝑙𝑙 𝑐𝑢𝑙𝑡𝑢𝑟𝑒 𝑎𝑟𝑒𝑎 (𝑐𝑚²)

Nei modelli di BBB on-chip, la misurazione del TEER costituisce un metodo rapido e non invasivo che consente una valutazione in tempo reale della qualità della barriera. Le misurazioni vengono eseguite applicando una bassa corrente elettrica attraverso lo strato cellulare e misurando l'entità dell'ostacolo opposto dalla barriera cellulare al passaggio della corrente stessa. I dispositivi organ-on-chip sono particolarmente adatti all'integrazione di sensori in grado di monitorare il TEER in tempo reale, operazione complessa in altre tipologie di dispositivi. I modelli in vitro della BBB devono raggiungere valori di TEER superiori a 150-200 Ωcm² per essere considerati accettabili [19]. Tale valore risulta inferiore di circa un fattore dieci rispetto ai risultati in vivo riportati in letteratura. La ragione per cui si accetta un valore di TEER sensibilmente inferiore è da attribuire alle condizioni semplificate proprie dei sistemi in vitro.

Permeabilità dei modelli di barriera emato-encefalica su chip

I modelli organ-on-chip possono fornire direttamente informazioni sulla funzione di barriera testandone la permeabilità a diverse sostanze. Risulta utile quantificare la permeabilità in modo tale da poterla agevolmente confrontare con i dati in vivo. Il trasporto passivo attraverso la barriera può essere quantificato a partire dal coefficiente di permeabilità di un analita che fluisce attraverso il chip. È opportuno evidenziare che fattori diversi dalla diffusione possono contribuire al trasporto, quali il flusso convettivo in presenza di discontinuità nella barriera cellulare e il flusso osmotico dovuto a differenze di concentrazione dei soluti tra i canali. Tale inconveniente può essere evitato controllando la concentrazione dei soluti nei canali e mantenendo la medesima pressione in entrambi i canali durante gli esperimenti. Poiché il trasporto di composti idrofili attraverso la barriera risulta fortemente limitato, tali composti, marcati con traccianti fluorescenti, vengono frequentemente impiegati negli studi di permeabilità. La permeabilità può quindi essere visualizzata mediante microscopia a fluorescenza.

Redatto da Emma Thomée, studentessa di dottorato per il progetto MAMI, con il supporto finanziario del programma di ricerca e innovazione Horizon 2020 dell'Unione Europea nell'ambito della convenzione di sovvenzione n. 766007.

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