La ricerca di materiali ultra-trasparenti per la produzione di chip microfluidici non è casuale. L’ultra-trasparenza di questi materiali si presta infatti molto bene alla microscopia, in particolare per le applicazioni biologiche. In questa breve rassegna, il nostro team di esperti presenta un protocollo semplice per la colorazione delle cellule nei chip. Questo protocollo funziona molto bene anche per gli sferoidi e gli organoidi.
Si potrebbe pensare che, per colorare le cellule coltivate in un chip microfluidico, basti colorarle prima di caricarle sul chip. Tuttavia, ciò non è sempre possibile quando il colorante da utilizzare è tossico per le cellule. Altre volte, invece, si desidera colorare cellule o tessuti appena formati. È quindi necessario conoscere i passaggi fondamentali che consentiranno di ottenere risultati positivi nella marcatura cellulare.
Un passaggio fondamentale prima della fase di colorazione è il cambio di fase. Il cambio di fase consiste nella rimozione dello strato di olio e tensioattivo presente sulla superficie delle gocce, al fine di introdurre un altro fluido (ad esempio un farmaco o una soluzione colorante).
Protocollo di cambiamento di fase su chip
Materiale
- Soluzione al 20% di PFO in HFE7500 per destabilizzare il tensioattivo (è possibile utilizzare una soluzione al 50% di PFO in HFE7500 se l'olio presente nel chip presenta un'elevata percentuale di tensioattivo (>1%))
- Siringa per olio
- Preparare la soluzione per la colorazione (vedere la sezione seguente)
Perfusione con olio
SCOPO: ridurre la concentrazione del tensioattivo mediante diluizione
- Scollegare l'uscita della camera
- Collegare la siringa per l'olio evitando la formazione di bolle d'aria
- Scollegare gli ingressi (camera, giunzione e celle) e collegare tube per le uscite
- Iniettare circa 500 µL di olio (o più) (a portata media, ovvero circa 100 µL/min)
Perfusione di PFO al 20% in HFE7500
SCOPO: destabilizzare il tensioattivo
- Rimuovere la siringa per l'olio
- Collegare la siringa PFO
- Iniettare circa 300-400 µL di PFO (a portata media, ovvero circa 100 µL/min)
Perfusione della fase acquosa
Nel nostro caso, si tratterà di soluzioni per la marcatura delle cellule secondo il seguente protocollo.
Per tutte le fasi di collegamento e scollegamento, il team di Darwin Microfluidics consiglia l’uso di valvole e di un separatore di bolle d’aria per facilitare l’esecuzione di questa procedura. Puoi trovare tutti i prodotti Darwin Microfluidics proprioqui.
Colorazione di cellule coltivate in un chip microfluidico
Materiale
- Soluzione di paraformaldeide (o PFA) al 4% per il fissaggio delle cellule
- Soluzione Triton x100 per la permeabilizzazione delle cellule (all’1% in PBS)
- Soluzione contenente l'1% di BSA in una soluzione al 5% di FBS in PBS
- Soluzione salina tamponata con fosfato (o PBS) per il lavaggio
- Soluzione di colorante o di anticorpi per la colorazione delle cellule
Fissazione delle cellule
SCOPO: Il PFA consente di arrestare le reazioni cellulari e di preservarne lo stato biologico (forma, ciclo cellulare, …)
- Collegare la siringa contenente PFA al 4% (circa 160 µl)
- Rispettare i 20 minuti di incubazione (una volta terminata l'infusione)
- Lavare con PBS (circa 160 µl)
Permeabilizzazione delle cellule
SCOPO: Aumentare la dimensione dei pori della membrana cellulare al fine favorirne l’ingresso dei coloranti. Il Triton X-100 è un detergente in grado di attaccare i lipidi della membrana cellulare
- Collegare la siringa Triton all’1% (circa 160 µl)
- Rispettare i 5 minuti di incubazione
- Lavare con PBS (circa 160 µl)
Blocco dei siti non specifici
SCOPO: Il BSA (in soluzione FBS) forma complessi con le proteine al fine di favorire interazioni competitive tra proteine e marcatori
- Perfusione con soluzione contenente l'1% di BSA in FBS al 5% in PBS (circa 160 µl)
- Incubazione: 60 min (non rigorosa)
- Lavare con PBS (circa 160 µl)
Fissaggio del colorante
SCOPO: Questa è la fase finale della colorazione. Questa fase deve essere eseguita al buio!
Sul mercato sono disponibili numerosi pennarelli in grado di soddisfare ogni vostra esigenza, qualunque sia l'applicazione. In questa fase prenderemo come esempio i pennarelli più comuni.
> Anticorpo I anti-caderina E e anticorpo II anti-capra [488] per evidenziare in verde le giunzioni cellula-cellula (diluiti in soluzione di BSA-FBS)
> La falloidina viene utilizzata per evidenziare in rosso l'actina polimerizzata (diluita in una soluzione di BSA-FBS)
- Perfusione con l'anticorpo I anti-caderina E diluito a 1/1000 in soluzione di BSA-FBS (circa 160 µl)
- Incubazione: 60 min
- Lavare con PBS (circa 160 µl)
- Perfusione con l'anticorpo II anti-capra [488] diluito a 1/1000 in soluzione di BSA-FBS (circa 160 µl)
- Incubazione: 60 min
- Lavare con PBS (circa 160 µl)
- Perfusione con falloidina diluita in rapporto 1:2000 in soluzione di BSA-FBS (circa 160 µl)
- Incubazione: 30 min
- Lavare con PBS (circa 160 µl)
Si noti che le diluizioni vengono effettuate in conformità con il protocollo del fornitore.
Per gestire al meglio le vostre soluzioni, gli esperti di Darwin Microfluidics vi consigliano di utilizzare rack per serbatoi e serbatoi microfluidici per provette Eppendorf. Scopritequi la gamma completa di serbatoi e contenitori disponibili su Darwin Microfluidics .
