La búsqueda de materiales ultratransparentes para fabricar chips microfluídicos no es casual. La ultratransparencia de estos materiales resulta muy adecuada para la microscopía, especialmente en aplicaciones biológicas. En esta breve revisión, nuestro equipo de expertos presenta un protocolo sencillo para la tinción de células en chips. Este protocolo también funciona muy bien con esferoides y organoides.
Quizá pienses que, para teñir células cultivadas en un chip microfluídico, basta con teñirlas antes de colocarlas en el chip. Sin embargo, esto no siempre es posible cuando el colorante que se va a utilizar es tóxico para las células. Otras veces, lo que se desea teñir son células o tejidos recién formados. Por lo tanto, es necesario conocer los pasos clave que te permitirán llevar a cabo con éxito el marcaje celular.
Un paso esencial previo a la fase de tinción es el cambio de fase. El cambio de fase consiste en eliminar la capa de aceite y tensioactivo presente en la superficie de las gotas con el fin de introducir otro fluido (por ejemplo, un fármaco o una solución de tinción).
Protocolo de cambio de fase en chip
Material
- Solución al 20 % de PFO en HFE7500 para desestabilizar el tensioactivo (es posible utilizar una solución al 50 % de PFO en HFE7500 si el aceite del chip tiene un alto porcentaje de tensioactivo (>1 %))
- Jeringa para aceite
- Preparar la solución para la tinción (véase la sección siguiente)
Perfusión con aceite
OBJETIVO: reducir la concentración de surfactante mediante dilución
- Desconecta la salida de la cámara
- Conecta la jeringa de aceite sin que se formen burbujas de aire.
- Desconecta las entradas (cámara, unión y celdas) y conecta un tube e para las salidas.
- Inyecta aproximadamente 500 µL de aceite (o más) (a un caudal medio, es decir, unos 100 µL/min)
Perfusión de PFO al 20 % en HFE7500
OBJETIVO: desestabilizar el tensioactivo
- Retira la jeringa de aceite
- Conecta la jeringa PFO
- Inyectar aproximadamente entre 300 y 400 µL de PFO (a un caudal medio, es decir, unos 100 µL/min)
Perfusión de la fase acuosa
En nuestro caso, se tratará de soluciones para marcar las células siguiendo el protocolo que se indica a continuación.
Para todas las fases de conexión y desconexión, el equipo de Darwin Microfluidics te recomienda el uso de válvulas y un purgador de burbujas de aire para facilitar este protocolo. Puedes encontrar todos los productos de Darwin Microfluidics aquí mismo.
Tinción de células cultivadas en un chip microfluídico
Material
- Solución de paraformaldehído (o PFA) al 4 % para fijar células
- Solución Triton x100 para la permeabilización de células (al 1 % en PBS)
- Solución de PBS con un 1 % de BSA y un 5 % de FBS
- Solución salina tamponada con fosfato (o PBS) para el lavado
- Solución de colorante o de anticuerpos para teñir células
Fijación de células
OBJETIVO: El PFA permite detener las reacciones celulares y mantener su estado biológico (forma, ciclo celular, etc.).
- Conecta la jeringa con solución de PFA al 4 % (aproximadamente 160 µl)
- Deja pasar 20 minutos de incubación (una vez finalizada la infusión).
- Lavar con PBS (aproximadamente 160 µl)
Permeabilización de las células
OBJETIVO: Aumentar el tamaño de los poros de la membrana celular con el fin favorecer la entrada de colorantes. El Triton X-100 es un detergente capaz de atacar los lípidos de la membrana celular
- Conecta la jeringa de Triton al 1 % (aproximadamente 160 µl)
- Dejar actuar durante 5 minutos
- Lavar con PBS (aproximadamente 160 µl)
Bloqueo de sitios no específicos
OBJETIVO: La BSA (en solución de FBS) forma complejos con las proteínas con el fin de favorecer las interacciones competitivas entre las proteínas y los marcadores.
- Perfusión con BSA al 1 % en FBS al 5 % en PBS (aproximadamente 160 µl)
- Incubación: 60 minutos (no es un tiempo estricto)
- Lavar con PBS (aproximadamente 160 µl)
Fijación del colorante
OBJETIVO: Este es el último paso de la tinción. ¡Este paso debe realizarse en la oscuridad!
En el mercado hay disponibles numerosos rotuladores que pueden satisfacer todas tus necesidades, sea cual sea tu aplicación. En este paso, tomaremos como ejemplo los rotuladores más comunes.
> Anticuerpo I anti-cadherina E y anticuerpo II anti-cabra [488] para visualizar las uniones célula-célula en verde (diluidos en una solución de BSA-FBS)
> La faloidina se utiliza para visualizar la actina polimerizada en rojo (diluida en una solución de BSA-FBS)
- Perfusión con el anticuerpo I anti-cadherina E diluido a 1/1000 en una solución de BSA-FBS (aproximadamente 160 µl)
- Incubación: 60 min
- Lavar con PBS (aproximadamente 160 µl)
- Perfusión con el anticuerpo II anti-cabra [488], diluido a 1/1000 en una solución de BSA-FBS (aproximadamente 160 µl)
- Incubación: 60 min
- Lavar con PBS (aproximadamente 160 µl)
- Perfusión con faloidina diluida a 1/2000 en una solución de BSA-FBS (aproximadamente 160 µl)
- Incubación: 30 minutos
- Lavar con PBS (aproximadamente 160 µl)
Ten en cuenta que las diluciones se realizan de acuerdo con el protocolo del proveedor.
Para manejar fácilmente tus soluciones, los expertos de Darwin Microfluidics te recomiendan utilizar bastidores para depósitos y depósitos microfluídicos para tubos Eppendorf. Descubreaquí la gama completa de depósitos y recipientes de Darwin Microfluidics .
