Órgano en chip para la investigación sobre la barrera hematoencefálica

Al combinar los principios de la microfluídica, la microfabricación y las técnicas de cultivo celular, ha surgido una nueva generación de plataformas de laboratorio, conocidas como «órganos en chip». Los sistemas «órgano en chip» son dispositivos microfluídicos que contienen células vivas. Estos dispositivos microfluídicos permiten reproducir mejor los microentornos en comparación con los modelos in vitro anteriores. Los dispositivos microfluídicos son especialmente adecuados para modelar barreras biológicas, como la barrera hematoencefálica, ya que permiten simular el flujo sanguíneo.

Estructura y función de la barrera hematoencefálica

La barrera hematoencefálica (BHE) es la capa de células que recubre los microvasos del cerebro y separa la sangre de los líquidos intersticiales cerebrales. La función principal de la barrera hematoencefálica es actuar como barrera física y metabólica, permitiendo el transporte selectivo de nutrientes a través de ella, pero impidiendo que las sustancias tóxicas presentes en la sangre penetren en el cerebro.

La BHE está formada por células endoteliales especializadas, rodeadas por una membrana basal y otros cuatro tipos de células: astrocitos, pericitos, neuronas y microglía. Estos cinco tipos de células, junto con la membrana basal, conforman la unidad neurovascular (figura 1) [1]. Entre las células endoteliales adyacentes de la BHE se forman complejos proteicos de sellado denominados uniones estrechas. Como resultado, las células se mantienen muy próximas entre sí, lo que ocluye los espacios intracelulares e impide el transporte paracelular. Esta elevada estanqueidad de la barrera es característica de la BHE y resulta crucial para mantener la homeostasis cerebral. Una alteración local de la estanqueidad de la barrera, que da lugar a una fuga a través de la misma, se asocia a varias enfermedades del sistema nervioso central (SNC) [2]. Comprender y superar la BHE es esencial para el tratamiento de las enfermedades del SNC. Los sistemas de administración de fármacos capaces de abrir temporalmente la barrera, permitiendo que los medicamentos la atraviesen y lleguen al cerebro, constituyen un área clave de investigación para el tratamiento de las enfermedades del SNC.

Modelos in vitro de la barrera hematoencefálica

En entornos artificiales, es posible mantener las condiciones bajo un estricto control y estudiar comportamientos específicos de forma independiente, con escasa interferencia de otros factores. Tradicionalmente, la barrera hematoencefálica (BHE) se ha reconstruido in vitro mediante modelos estáticos que utilizan sistemas convencionales de cultivo celular. Los dispositivos microfluídicos de «órgano en chip» ofrecen soluciones a muchas de las deficiencias de los modelos in vitro anteriores. Estos dispositivos pueden diseñarse con arquitecturas más realistas y sus pequeñas dimensiones representan mejor la geometría de los capilares de la unidad neurovascular. Además, al emplear la microfluídica en lugar de realizar experimentos en una solución a granel, los modelos pueden reproducir fenómenos fisiológicos como los flujos de fluidos y las tensiones de cizallamiento. Otra ventaja de los modelos de BHE en chip es que permiten integrar sensores para la monitorización en tiempo real [3].

Barrera hematoencefálica en un chip microfluídico

A continuación se presentan dos de los primeros dispositivos microfluídicos que han sido pioneros en el desarrollo de la «barrera hematoencefálica en chip» y que han demostrado la viabilidad de varios conceptos prometedores. También se expondrán algunos aspectos importantes del diseño y parámetros de validación que deben tenerse en cuenta a la hora de desarrollar un dispositivo de «órgano en chip» para estudiar la barrera hematoencefálica. En la actualidad, existen en el mercado chips listos para usar destinados a aplicaciones de «órgano en chip», o bien pueden encargarse a medida.

Según tenemos constancia, Booth et al. fueron los primeros en publicar un modelo de la barrera hematoencefálica (BHE) en chip en 2012 [4], al que siguió un artículo en 2014 [5]. Su dispositivo, que se muestra en la figura 2, consta de dos canales que se cruzan en capas de PDMS, con una profundidad de 200 µm y una anchura de 2 mm y 5 mm, respectivamente. Los dos canales estaban separados por una membrana porosa de policarbonato recubierta de fibronectina. Las capas de los canales estaban cubiertas por portaobjetos de vidrio con electrodos de película delgada de Ag/AgCl, con una estructura de detección de cuatro puntos situada sobre la membrana. Se cultivaron conjuntamente células endoteliales de ratón (b.End3) y astrocitos murinos (C8D1A) en lados opuestos de la membrana. Se aplicó un caudal de 2,6 mL/min en ambos canales, lo que, según los cálculos presentados en el artículo, correspondía a una tensión de cizallamiento de 2 mPa sobre las células endoteliales. Se midió la resistencia eléctrica transendotelial (TEER) en un rango de 180-280 Vcm² con los electrodos de película delgada integrados. Además, se identificó la proteína de unión estrecha ZO-1 mediante inmunofluorescencia y se realizaron estudios de permeabilidad para confirmar la función de barrera.

Griep et al. publicaron en 2013 otro dispositivo BBB totalmente integrado [6]. El dispositivo estaba compuesto por dos capas de PDMS que formaban canales de 500 µm de anchura y 100 µm de profundidad, con una membrana de policarbonato recubierta de colágeno entre ellas. Se cultivaron células endoteliales microvasculares cerebrales humanas (hCMEC/D3) sobre la membrana. Utilizaron cuatro hilos de platino para monitorizar el valor de TEER durante 7 días a partir de mediciones de espectroscopia de impedancia. Obtuvieron un valor medio de TEER de 28 Vcm² ± 1,3 (SEM). Observaron un aumento del TEER, hasta 120 Vcm², cuando se aplicó un caudal de 2,5 mL/h, lo que correspondía a una tensión de cizallamiento calculada de 0,58 Pa.

Material para chips de «órgano en chip»

El PDMS se ha utilizado ampliamente para fabricar dispositivos de «órgano en chip». Entre las ventajas del PDMS destacan su biocompatibilidad y transparencia (240 nm – 1100 nm), su bajo coste y facilidad de manejo, la posibilidad de moldearlo con alta resolución y su capacidad para adherirse al vidrio o al propio PDMS [7]. Sin embargo, es un material muy hidrófobo, lo que puede suponer un problema a la hora de rellenar los canales u obtener una unión hermética para que los chips no presenten fugas. Además, resulta difícil depositar electrodos sobre la superficie del PDMS, por lo que a menudo se utiliza vidrio en los dispositivos con electrodos de película fina estampados.

Células en modelos de barrera hematoencefálica en chip

El tipo de células utilizadas reviste una gran importancia a la hora de construir modelos con relevancia biológica. Sin embargo, aún no está claro exactamente cómo contribuyen las diferentes células de la unidad neurovascular a la función de barrera [8]. Para imitar la barrera hematoencefálica humana, el uso de células humanas sería, obviamente, lo más predictivo. Las células endoteliales capilares del cerebro humano se han caracterizado ampliamente, pero presentan una baja disponibilidad y reproducibilidad [1]. Los recientes avances en la obtención de células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSC) son muy prometedores para superar estas dificultades [9].

Se espera que el cocultivo de células endoteliales con otras células de la unidad neurovascular constituya una representación más relevante desde el punto de vista fisiológico, ya que estas células también influyen en la formación y el mantenimiento de la barrera [10]. Ya se han publicado varios estudios sobre cocultivos en modelos microfluídicos de la BHE, principalmente de células endoteliales con astrocitos [4] [11], pero también con neuronas [12] y pericitos. Los astrocitos y las células endoteliales no están en contacto directo entre sí, sino que están separados por la lámina basal. En los dispositivos microfluídicos, pueden cultivarse en lados separados de la membrana. Sin embargo, si la membrana del dispositivo es demasiado gruesa, el contacto célula-célula se verá limitado. Para imitar el entorno tridimensional de la matriz extracelular, se han utilizado hidrogeles como andamios para la siembra celular en el interior de las cámaras microfluídicas [12].

Esfuerzo de cizallamiento en las células endoteliales

Las células endoteliales de la barrera hematoencefálica (BHE) en la unidad neurovascular están sometidas a una fuerza normal a la pared vascular debida a la presión sanguínea, así como a una tensión de cizallamiento derivada del flujo sanguíneo, en la dirección del flujo. Ya se ha descrito que las tensiones de cizallamiento influyen en la morfología y la función de las células endoteliales, y que tienen un efecto positivo en la formación de la barrera [13]. Los dispositivos «órgano en chip» tienen la gran ventaja de ser adecuados para incorporar un flujo de fluido, a diferencia de otros tipos de dispositivos. Los vasos sanguíneos vivos tienen secciones transversales circulares, mientras que los dispositivos microfluídicos suelen tener secciones transversales rectangulares. En un tubo con sección transversal circular, la tensión de cizallamiento será igual y uniforme en las paredes debido a la simetría cilíndrica. Sin embargo, en el caso de una sección transversal rectangular, la tensión de cizallamiento no será uniforme. Para lograr la tensión más uniforme posible en una sección transversal rectangular, se puede conseguir un perfil de flujo lo más plano posible diseñando los canales de tal forma que su altura sea mucho menor que su anchura [14]. La tensión de cizallamiento fisiológica de los capilares cerebrales es de 0,3-2 Pa [2].

Resistencia eléctrica transendotelial (TEER)

El TEER describe la resistencia a través de una barrera celular y se utiliza a menudo como parámetro de validación para comprobar si las células endoteliales en los modelos de la barrera hematoencefálica (BHE) forman complejos de uniones estrechas [15]. Si las células endoteliales crecen correctamente y forman uniones estrechas con las células adyacentes, los espacios intercelulares de la capa celular quedan ocluidos y se restringe el flujo de corriente a través de ellos [16]. Esto induce una mayor resistencia a la corriente, lo que se refleja en valores más altos de TEER. El TEER suele expresarse normalizado respecto al área de la membrana en la unidad^Ωcm², como se muestra a continuación, para facilitar la comparación directa con otros modelos.

𝑇𝐸𝐸𝑅 (Ω^𝑐𝑚²) = 𝑅𝑒𝑠𝑖𝑠𝑡𝑎𝑛𝑐𝑒 (Ω) × 𝐶𝑒𝑙𝑙 𝑐𝑢𝑙𝑡𝑢𝑟𝑒 𝑎𝑟𝑒𝑎 (^𝑐𝑚²)

En los modelos de la barrera hematoencefálica (BHE) «on-chip», la medición de la resistencia transendotelial (TEER) es un método rápido y no invasivo que permite evaluar en tiempo real la calidad de la barrera. Las mediciones se realizan aplicando una corriente eléctrica de baja intensidad a través de la capa celular, al tiempo que se mide en qué medida dicha corriente se ve obstaculizada por dicha capa. Los dispositivos «organ-on-chip» son adecuados para integrar sensores que permitan monitorizar la TEER en tiempo real, algo que resulta difícil en otros tipos de dispositivos. Los modelos in vitrode la BHE deben alcanzar valores de TEER superiores a 150-200^Ωcm²para que se consideren modelos aceptables [19]. Esto supone aproximadamente un factor de diez inferior a losresultados in vivodescritos. La razón por la que se acepta un TEER mucho más bajo se debe a las condiciones simplificadasin vitro.

Permeabilidad de los modelos de barrera hematoencefálica en chip

Los modelos «órgano en chip» pueden proporcionar información directa sobre la función de barrera mediante el análisis de la permeabilidad de la barrera a diferentes sustancias. Resulta útil cuantificar la permeabilidad de tal forma que pueda compararse fácilmente con los datos in vivo. El transporte pasivo a través de la barrera puede cuantificarse a partir del coeficiente de permeabilidad de un analito que fluye a través del chip. Cabe señalar que, además de la difusión, pueden contribuir al transporte otros factores, como el flujo convectivo —si existen huecos en la barrera celular— y el flujo osmótico debido a las diferencias en las concentraciones de soluto entre los canales. Esto puede evitarse controlando la concentración de soluto en los canales y manteniendo la misma presión en ambos canales durante los experimentos. Dado que el transporte de compuestos hidrofílicos a través de la barrera es muy limitado, estos compuestos marcados con trazadores fluorescentes se utilizan a menudo para estudios de permeabilidad. La permeabilidad puede visualizarse entonces con un microscopio de fluorescencia.

Escrito por Emma Thomée, estudiante de doctorado del proyecto MAMI, con financiación del programa de investigación e innovación «Horizonte 2020» de la Unión Europea, en el marco del acuerdo de subvención n.º 766007.

Bibliografía

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