Organ-on-a-Chip für die Erforschung der Blut-Hirn-Schranke

Durch die Kombination von Prinzipien der Mikrofluidik, der Mikrofabrikation und Zellkulturtechniken ist eine neue Generation von Laborplattformen entstanden, die als „Organ-on-Chip“ bekannt sind. Organ-on-Chip-Systeme sind mikrofluidische Vorrichtungen, die lebende Zellen enthalten. Diese mikrofluidischen Systeme können Mikromilieus im Vergleich zu früheren In-vitro-Modellen realistischer nachbilden. Mikrofluidische Vorrichtungen eignen sich besonders gut zur Modellierung biologischer Barrieren, wie etwa der Blut-Hirn-Schranke, da sie den Blutfluss simulieren können.

Struktur und Funktion der Blut-Hirn-Schranke

Die Blut-Hirn-Schranke (BHS) ist die grenzbildende Schicht aus Endothelzellen, die die mikroskopischen Blutgefäße des Gehirns auskleidet und das Blut von der interstitiellen Flüssigkeit des Gehirns trennt. Die Hauptfunktion der Blut-Hirn-Schranke besteht darin, als physikalische und metabolische Barriere zu wirken, indem sie den selektiven Transport von Nährstoffen ermöglicht, gleichzeitig aber das Eindringen toxischer Substanzen aus dem Blut in das Gehirn verhindert.

Die BHS besteht aus spezialisierten Endothelzellen, die von einer Basalmembran und vier weiteren Zelltypen umgeben sind: Astrozyten, Perizyten, Neuronen und Mikroglia. Diese fünf Zelltypen bilden zusammen mit der Basalmembran die neurovaskuläre Einheit (Abbildung 1) [1]. Zwischen benachbarten Endothelzellen der BHS bilden sich abdichtende Proteinkomplexe, die sogenannten Tight Junctions (Schlussleisten). Infolgedessen liegen die Zellen dicht beieinander, wodurch die interzellulären Räume verschlossen und der parazelluläre Transport verhindert wird. Diese hohe Dichtigkeit der Barriere ist charakteristisch für die BHS und entscheidend für die Aufrechterhaltung der Homöostase des Gehirns. Eine lokale Störung dieser Barrierendichtigkeit, die zu einer Leckage führt, ist mit mehreren Erkrankungen des zentralen Nervensystems (ZNS) verbunden [2]. Das Verständnis und die Überwindung der BHS sind für die Behandlung von ZNS-Erkrankungen von essenzieller Bedeutung. Wirkstoffträgersysteme, die die Barriere vorübergehend öffnen können, damit Medikamente diese passieren und das Gehirn erreichen können, stellen einen zentralen Forschungsbereich für die Behandlung von ZNS-Erkrankungen dar.

In-vitro-Modelle der Blut-Hirn-Schranke

In künstlichen Umgebungen lassen sich die Bedingungen streng kontrollieren und spezifische Verhaltensweisen unabhängig voneinander untersuchen, ohne nennenswerte Beeinflussung durch andere Faktoren. Traditionell wurde die BHS in vitro als statisches Modell unter Verwendung herkömmlicher Zellkulturaufbauten rekonstruiert. Mikrofluidische Organ-on-Chip-Systeme bieten Lösungen für viele der Mängel früherer In-vitro-Modelle. Diese Systeme können mit realistischeren Architekturen entworfen werden, und ihre geringen Abmessungen entsprechen eher der Geometrie der Kapillaren in der neurovaskulären Einheit. Darüber hinaus ermöglichen diese Modelle durch den Einsatz der Mikrofluidik anstelle von Experimenten in einer Standard-Flüssigphase die Darstellung physiologischer Phänomene wie Strömungen und Scherkräfte. Ein weiterer Vorteil von BBB-on-Chip-Modellen (Blut-Hirn-Schranken-Chips) besteht darin, dass Sensoren für die Echtzeitüberwachung integriert werden können [3].

Blut-Hirn-Schranke auf einem mikrofluidischen Chip

Zwei der frühen mikrofluidischen Systeme, die die Entwicklung von BBB-on-Chip-Modellen vorangetrieben und den Machbarkeitsnachweis (Proof-of-Principle) für mehrere vielversprechende Konzepte erbracht haben, werden nachfolgend vorgestellt. Zudem werden einige wichtige Designaspekte und Validierungsparameter vorgestellt, die bei der Entwicklung eines Organ-on-Chip-Systems zur Untersuchung der BHS berücksichtigt werden müssen. Heutzutage sind gebrauchsfertige Chips für Organ-on-Chip-Anwendungen kommerziell erhältlich oder können nach Maß bestellt werden.

Nach unserem Kenntnisstand waren Booth et al. die Ersten, die 2012 ein BBB-on-Chip-Modell publizierten [4], gefolgt von einer weiteren Arbeit im Jahr 2014 [5]. Ihr in Abbildung 2 dargestelltes System umfasst zwei sich kreuzende Kanäle in PDMS-Schichten mit einer Tiefe von 200 µm und einer Breite von 2 mm bzw. 5 mm. Die beiden Kanäle wurden durch eine poröse Polycarbonatmembran getrennt, die mit Fibronectin beschichtet war. Die Kanalstrukturen wurden mit Glasobjektträgern abgedeckt, auf denen Dünnschicht-Ag/AgCl-Elektroden mit einer Vierpunkt-Messstruktur über der Membran platziert waren. Maus-Endothelzellen (b.End3) und murine Astrozyten (C8D1A) wurden auf gegenüberliegenden Seiten der Membran koestzultiviert. In beiden Kanälen wurde eine Flussrate von 2,6 mL/min angelegt, was gemäß den Berechnungen im Paper einer Scherkraft von 2 mPa auf die Endothelzellen entsprach. Der transendotheliale elektrische Widerstand (TEER) wurde mit den integrierten Dünnschichtelektroden zu 180–280 Ωcm² gemessen. Darüber hinaus wurde das Tight-Junction-Protein ZO-1 mittels Immunfluoreszenz nachgewiesen und Permeabilitätsstudien durchgeführt, um die Barrierefunktion zu bestätigen.

Ein weiteres vollständig integriertes BHS-System wurde 2013 von Griep et al. veröffentlicht [6]. Das System bestand aus zwei PDMS-Schichten mit Kanälen einer Breite von 500 µm und einer Tiefe von 100 µm, zwischen denen sich eine mit Kollagen beschichtete Polycarbonatmembran befand. Humane zerebrale mikrovaskuläre Endothelzellen (hCMEC/D3) wurden auf der Oberseite der Membran kultiviert. Sie verwendeten vier Platindrähte, um den TEER-Wert über einen Zeitraum von 7 Tagen mittels Impedanzspektroskopie zu überwachen. Sie ermittelten einen durchschnittlichen TEER-Wert von 28 Ωcm² ± 1,3 SEM). Sie beobachteten einen Anstieg des TEER-Wertes auf bis zu 120 Ωcm², als eine Flussrate von 2,5 mL/h angelegt wurde, was einer berechneten Scherkraft von 0,58 Pa entsprach.

Chip-Material für Organ-on-Chip

PDMS wird häufig für die Herstellung von Organ-on-Chip-Systemen eingesetzt. Zu den Vorteilen von PDMS gehören seine Biokompatibilität und Transparenz (240 nm – 1100 nm), die kostengünstige und einfache Handhabung sowie die Möglichkeit, es mit hoher Auflösung zu formen und mit Glas oder PDMS zu verbinden [7]. Es ist jedoch stark hydrophob, was beim Befüllen der Kanäle oder beim Erreichen einer dichten, leckagefreien Verbindung problematisch sein kann. Darüber hinaus ist es schwierig, Elektroden auf der Oberfläche von PDMS abzuscheiden, weshalb bei Systemen mit strukturierten Dünnschichtelektroden häufig Glas verwendet wird.

Zellen in Blutschranken-Modellen auf dem Chip (Blood-Brain Barrier on a Chip)

Die Art der verwendeten Zellen ist von entscheidender Bedeutung, um biologisch relevante Modelle zu konstruieren. Es ist jedoch nach wie vor unklar, wie genau die verschiedenen Zellen der neurovaskulären Einheit zur Barrierefunktion beitragen [8]. Um die menschliche Blut-Hirn-Schranke (BHS) zu imitieren, wäre die Verwendung menschlicher Zellen offensichtlich am aussagekräftigsten. Kapillarendothelzellen des menschlichen Gehirns wurden zwar umfassend charakterisiert, weisen jedoch eine geringe Verfügbarkeit und Reproduzierbarkeit auf [1]. Jüngste Fortschritte bei der Gewinnung humaner induzierter pluripotenter Stammzellen (hiPSC) bieten vielversprechende Ansätze zur Bewältigung dieser Schwierigkeiten [9].

Es wird erwartet, dass die Co-Kultivierung von Endothelzellen mit anderen Zellen der neurovaskulären Einheit eine physiologisch relevantere Repräsentation darstellt, da diese Zellen auch die Ausbildung und Aufrechterhaltung der Barriere beeinflussen [10]. Mehrere Studien zu Co-Kulturen in mikrofluidischen BHS-Modellen wurden bereits veröffentlicht, hauptsächlich mit Endothelzellen und Astrozyten [4] [11], aber auch mit Neuronen [12] und Perizyten. Astrozyten und Endothelzellen stehen nicht in direktem Kontakt miteinander, sondern sind durch die Lamina basalis getrennt. In mikrofluidischen Systemen können sie auf gegenüberliegenden Seiten der Membran kultiviert werden. Ist die Membran im System jedoch zu dick, ist der Zell-Zell-Kontakt eingeschränkt. Zur Nachbildung der 3D-Umgebung der extrazellulären Matrix wurden Hydrogele als zellbesiedelbare Matrices in mikrofluidischen Kammern eingesetzt [12].

Schubspannung an Endothelzellen

Die Endothelzellen der BHS in der neurovaskulären Einheit sind aufgrund des Blutdrucks einer Kraft ausgesetzt, die senkrecht auf die Gefässwand wirkt, sowie einer Schubspannung (shear stress) durch den Blutfluss in Richtung des Flusses. Es wurde bereits berichtet, dass Schubspannungen die Morphologie und Funktion von Endothelzellen beeinflussen und sich positiv auf die Barrierebildung auswirken [13]. Organ-on-Chip-Systeme haben im Gegensatz zu anderen Gerätetypen den grossen Vorteil, dass sie sich für die Integration von Flüssigkeitsströmungen eignen. Lebende Blutgefässe weisen kreisförmige Querschnitte auf, während mikrofluidische Systeme typischerweise rechteckige Querschnitte besitzen. In einem Schlauch mit kreisförmigem Querschnitt ist die Schubspannung aufgrund der zylindrischen Symmetrie an den Wänden gleichmässig und konstant. Bei einem rechteckigen Querschnitt ist die Schubspannung hingegen nicht homogen. Um eine möglichst gleichmässige Spannung in einem rechteckigen Querschnitt zu erreichen, lässt sich ein möglichst flaches Strömungsprofil erzeugen, indem die Kanäle so ausgelegt werden, dass ihre Höhe deutlich geringer ist als ihre Breite [14]. Die physiologische Schubspannung für Hirnkapillaren liegt bei 0,3–2 Pa [2].

Transendothelialer elektrischer Widerstand (TEER)

Der TEER-Wert beschreibt den Widerstand über eine zelluläre Barriere und wird häufig als Validierungsparameter herangezogen, um zu überprüfen, ob Endothelzellen in BHS-Modellen Tight-Junction-Komplexe ausbilden [15]. Wachsen die Endothelzellen ordnungsgemäss und bilden sie tight junctions zu benachbarten Zellen aus, werden die interzellulären Räume der Zellschicht okkludiert und der Stromfluss durch sie hindurch wird eingeschränkt [16]. Dies führt zu einem höheren Widerstand gegenüber dem Strom, was sich in erhöhten TEER-Werten niederschlägt. Um einen direkten Vergleich mit anderen Modellen zu ermöglichen, wird der TEER häufig – wie nachstehend – auf die Membranfläche normiert in der Einheit Ωcm² angegeben.

𝑇𝐸𝐸𝑅 (Ω 𝑐𝑚²) = 𝑅𝑒𝑠𝑖𝑠𝑡𝑎𝑛𝑐𝑒 (Ω) × 𝐶𝑒𝑙𝑙𝑟𝑒𝑑𝑒𝑠𝑟𝑎𝑟𝑒 (𝑐𝑚²)

Bei BHS-On-Chip-Modellen stellt die Messung des TEER eine schnelle, nicht-invasive Methode dar, die eine Echtzeit-Bewertung der Barrierequalität ermöglicht. Die Messungen werden durchgeführt, indem ein schwacher elektrischer Strom an die Zellschicht angelegt und gemessen wird, in welchem Maße der Strom durch die Zellschicht behindert wird. Organ-on-Chip-Systeme eignen sich hervorragend für die Integration von Sensoren, mit denen sich der TEER in Echtzeit überwachen lässt, was bei anderen Gerätetypen nur schwer möglich ist. In-vitro-Modelle der BHS müssen TEER-Werte von über 150–200 Ωcm² erreichen, um als akzeptable Modelle zu gelten [19]. Dies ist etwa ein Zehntel des Wertes der berichteten in-vivo-Ergebnisse. Der Grund dafür, dass ein deutlich niedrigerer TEER-Wert akzeptiert wird, liegt in den vereinfachten In-vitro-Bedingungen.

Permeabilität von Blutschranken-Modellen auf dem Chip

Organ-on-Chip-Modelle können durch die Prüfung der Permeabilität der Barriere für verschiedene Substanzen direkte Aufschlüsse über die Barrierefunktion liefern. Es ist von Vorteil, die Permeabilität so zu quantifizieren, dass sie sich problemlos mit in-vivo-Daten vergleichen lässt. Der passive Transport über die Barriere kann anhand des Permeabilitätskoeffizienten eines Analyten quantifiziert werden, der durch den Chip strömt. Es ist zu beachten, dass neben der Diffusion auch andere Faktoren zum Transport beitragen können, wie etwa konvektive Strömung bei Lücken in der Zellbarriere sowie osmotische Strömung aufgrund von Konzentrationsunterschieden des gelösten Stoffes zwischen den Kanälen. Dies lässt sich vermeiden, indem die Konzentration der gelösten Stoffe in den Kanälen kontrolliert wird und während der Experimente in beiden Kanälen derselbe Druck herrscht. Da der Transport hydrophiler Verbindungen durch die Barriere stark eingeschränkt ist, werden für Permeabilitätsstudien häufig mit fluoreszierenden Tracern markierte Verbindungen eingesetzt. Die Permeabilität kann daraufhin mit einem Fluoreszenzmikroskop visualisiert werden.

Verfasst von Emma Thomée, Doktorandin für das MAMI-Projekt, mit Finanzierung aus dem Forschungs- und Innovationsprogramm Horizont 2020 der Europäischen Union im Rahmen der Finanzhilfevereinbarung Nr. 766007.

Literaturverzeichnis

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