Organ-on-Chip für die Erforschung der Blut-Hirn-Schranke

Durch die Kombination der Prinzipien der Mikrofluidik, der Mikrofabrikation und der Zellkulturtechniken ist eine neue Generation von Laborplattformen entstanden, die als „Organ-on-Chip“ bekannt ist. „Organ-on-Chip“-Systeme sind mikrofluidische Vorrichtungen, die lebende Zellen enthalten. Diese mikrofluidischen Vorrichtungen können Mikroumgebungen im Vergleich zu früheren In-vitro-Modellen besser nachbilden. Mikrofluidische Vorrichtungen eignen sich besonders gut für die Modellierung biologischer Barrieren wie der Blut-Hirn-Schranke, da sie den Blutfluss simulieren können.

Aufbau und Funktion der Blut-Hirn-Schranke

Die Blut-Hirn-Schranke (BHS) ist die Zellschicht, die die Mikrogefäße des Gehirns auskleidet und das Blut von der interstitiellen Flüssigkeit des Gehirns trennt. Die Hauptfunktion der Blut-Hirn-Schranke besteht darin, als physikalische und metabolische Barriere zu wirken, indem sie den selektiven Transport von Nährstoffen ermöglicht, aber verhindert, dass toxische Substanzen aus dem Blut ins Gehirn gelangen.

Die Blut-Hirn-Schranke (BHS) besteht aus spezialisierten Endothelzellen, die von einer Basalmembran und vier weiteren Zelltypen umgeben sind: Astrozyten, Perizyten, Neuronen und Mikroglia. Diese fünf Zelltypen bilden zusammen mit der Basalmembran die neurovaskuläre Einheit (Abbildung 1) [1]. Zwischen benachbarten Endothelzellen der Blut-Hirn-Schranke bilden sich abdichtende Proteinkomplexe, sogenannte Tight Junctions. Dadurch werden die Zellen eng aneinander gehalten, wodurch die intrazellulären Räume verschlossen und der parazelluläre Transport verhindert wird. Diese hohe Barrierefestigkeit ist charakteristisch für die Blut-Hirn-Schranke und entscheidend für die Aufrechterhaltung der Homöostase des Gehirns. Eine lokale Störung der Barrierefestigkeit, die zu einer Undichtigkeit der Barriere führt, steht im Zusammenhang mit verschiedenen Erkrankungen des Zentralnervensystems (ZNS) [2]. Das Verständnis und die Überwindung der Blut-Hirn-Schranke sind für die Behandlung von Erkrankungen des ZNS von entscheidender Bedeutung. Arzneimittelverabreichungssysteme, die die Barriere vorübergehend öffnen können, sodass Medikamente hindurchgelangen und das Gehirn erreichen, sind ein zentraler Forschungsbereich für die Behandlung von ZNS-Erkrankungen.

In-vitro-Modelle der Blut-Hirn-Schranke

In künstlichen Umgebungen lassen sich die Bedingungen genau kontrollieren und bestimmte Verhaltensweisen unabhängig und nahezu ohne Einfluss anderer Faktoren untersuchen. Bislang wurde die Blut-Hirn-Schranke (BHS) in vitro als statisches Modell unter Verwendung herkömmlicher Zellkultursysteme nachgebildet. Mikrofluidische „Organ-on-Chip“-Systeme bieten Lösungen für viele der Mängel früherer In-vitro-Modelle. Diese Systeme können mit realistischeren Architekturen konzipiert werden, und ihre geringen Abmessungen spiegeln die Geometrie der Kapillaren in der neurovaskulären Einheit besser wider. Darüber hinaus können die Modelle durch den Einsatz von Mikrofluidik anstelle von Experimenten in einer Volumenlösung physiologische Phänomene wie Flüssigkeitsströmungen und Scherspannungen abbilden. Ein weiterer Vorteil von BBB-on-Chip-Modellen besteht darin, dass Sensoren zur Echtzeitüberwachung integriert werden können [3].

Blut-Hirn-Schranke auf einem Mikrofluidik-Chip

Im Folgenden werden zwei der frühen mikrofluidischen Geräte vorgestellt, die Pionierarbeit bei der Entwicklung von „BBB-on-Chip“-Systemen geleistet und den Proof-of-Principle für mehrere vielversprechende Konzepte erbracht haben. Außerdem werden einige wichtige Designaspekte und Validierungsparameter vorgestellt, die bei der Entwicklung eines „Organ-on-Chip“-Geräts zur Untersuchung der Blut-Hirn-Schranke zu berücksichtigen sind. Heute sind gebrauchsfertige Chips für „Organ-on-Chip“-Anwendungen im Handel erhältlich oder können maßgeschneidert bestellt werden.

Nach unserem Kenntnisstand waren Booth et al. die Ersten, die 2012 ein On-Chip-Modell der Blut-Hirn-Schranke veröffentlichten [4], gefolgt von einer Folgearbeit im Jahr 2014 [5]. Ihre Vorrichtung, die in Abbildung 2 dargestellt ist, besteht aus zwei sich kreuzenden Kanälen in PDMS-Schichten mit einer Tiefe von 200 µm und einer Breite von 2 mm bzw. 5 mm. Die beiden Kanäle waren durch eine poröse, mit Fibronektin beschichtete Polycarbonatmembran voneinander getrennt. Die Kanalschichten wurden mit Objektträgern abgedeckt, auf denen sich dünnschichtige Ag/AgCl-Elektroden mit einer Vierpunkt-Messstruktur über der Membran befanden. Maus-Endothelzellen (b.End3) und murine Astrozyten (C8D1A) wurden auf gegenüberliegenden Seiten der Membran kokultiviert. In beiden Kanälen wurde eine Durchflussrate von 2,6 ml/min angelegt, was gemäß den in der Arbeit vorgestellten Berechnungen einer Scherspannung von 2 mPa auf die Endothelzellen entsprach. Der transendotheliale elektrische Widerstand (TEER) wurde mit den integrierten Dünnschichtelektroden im Bereich von 180–280 V/cm² gemessen. Darüber hinaus wurde das Tight-Junction-Protein ZO-1 mittels Immunfluoreszenz nachgewiesen, und es wurden Permeabilitätsuntersuchungen durchgeführt, um die Barrierefunktion zu bestätigen.

Ein weiteres vollständig integriertes BBB-Gerät wurde 2013 von Griep et al. veröffentlicht [6]. Das Gerät bestand aus zwei PDMS-Schichten mit Kanälen von 500 µm Breite und 100 µm Tiefe, zwischen denen sich eine mit Kollagen beschichtete Polycarbonatmembran befand. Auf der Membran wurden menschliche zerebrale mikrovaskuläre Endothelzellen (hCMEC/D3) kultiviert. Zur Überwachung des TEER-Werts über einen Zeitraum von 7 Tagen verwendeten sie vier Platindrähte, um Impedanzspektroskopie-Messungen durchzuführen. Sie ermittelten einen durchschnittlichen TEER-Wert von 28 Vcm² ± 1,3 (SEM). Bei einer Durchflussrate von 2,5 ml/h, was einer berechneten Scherspannung von 0,58 Pa entsprach, beobachteten sie einen Anstieg des TEER-Werts auf bis zu 120 Vcm².

Chipmaterial für „Organ-on-Chip“-Anwendungen

PDMS wird in großem Umfang zur Herstellung von „Organ-on-Chip“-Bauelementen verwendet. Zu den Vorteilen von PDMS zählen seine Biokompatibilität und Transparenz (240 nm – 1100 nm), seine Kostengünstigkeit und einfache Handhabung, die Möglichkeit, es mit hoher Auflösung zu formen, sowie seine Haftfähigkeit auf Glas oder PDMS [7]. Es ist jedoch stark hydrophob, was beim Befüllen der Kanäle oder beim Herstellen einer dichten Verbindung für leckagefreie Chips problematisch sein kann. Darüber hinaus ist es schwierig, Elektroden auf die Oberfläche von PDMS aufzubringen, weshalb bei Geräten mit strukturierten Dünnschichtelektroden häufig Glas verwendet wird.

Zellen in Modellen der Blut-Hirn-Schranke auf einem Chip

Die Art der verwendeten Zellen ist für die Erstellung biologisch relevanter Modelle von großer Bedeutung. Es ist jedoch noch unklar, wie genau die verschiedenen Zellen der neurovaskulären Einheit zur Barrierefunktion beitragen [8]. Um die menschliche Blut-Hirn-Schranke nachzubilden, wäre die Verwendung menschlicher Zellen offensichtlich am aussagekräftigsten. Menschliche Hirnkapillarendothelzellen wurden bereits umfassend charakterisiert, weisen jedoch eine geringe Verfügbarkeit und Reproduzierbarkeit auf [1]. Jüngste Fortschritte bei der Gewinnung humaner induzierter pluripotenter Stammzellen (hiPSC) sind vielversprechend, um solche Schwierigkeiten zu überwinden [9].

Die Kokultur von Endothelzellen mit anderen Zellen der neurovaskulären Einheit dürfte eine physiologisch relevantere Nachbildung darstellen, da auch diese Zellen die Bildung und Aufrechterhaltung der Barriere beeinflussen [10]. Es wurden bereits mehrere Studien zu Kokulturen in mikrofluidischen BBB-Modellen veröffentlicht, hauptsächlich zu Endothelzellen mit Astrozyten [4] [11], aber auch mit Neuronen [12] und Perizyten. Astrozyten und Endothelzellen stehen nicht in direktem Kontakt miteinander, sondern sind durch die Basallamina voneinander getrennt. In mikrofluidischen Systemen können sie auf getrennten Seiten der Membran kultiviert werden. Ist die Membran im System jedoch zu dick, wird der Zell-Zell-Kontakt eingeschränkt. Um die 3D-Umgebung der extrazellulären Matrix nachzubilden, wurden Hydrogele als Gerüste für die Zellaussaat innerhalb mikrofluidischer Kammern verwendet [12].

Scherbeanspruchung von Endothelzellen

Die Endothelzellen der Blut-Hirn-Schranke in der neurovaskulären Einheit sind aufgrund des Blutdrucks einer Kraft senkrecht zur Gefäßwand sowie einer durch die Blutströmung verursachten Scherspannung in Strömungsrichtung ausgesetzt. Es wurde bereits berichtet, dass Scherspannungen die Morphologie und Funktion der Endothelzellen beeinflussen und sich positiv auf die Barrierebildung auswirken [13]. „Organ-on-Chip“-Systeme haben den großen Vorteil, dass sie sich im Gegensatz zu anderen Systemtypen für die Einbeziehung von Flüssigkeitsströmungen eignen. Lebende Blutgefäße weisen kreisförmige Querschnitte auf, während mikrofluidische Systeme typischerweise rechteckige Querschnitte haben. In einem Rohr mit kreisförmigem Querschnitt ist die Scherspannung aufgrund der zylindrischen Symmetrie an den Wänden gleichmäßig verteilt. Bei einem rechteckigen Querschnitt ist die Scherspannung jedoch nicht gleichmäßig. Um eine möglichst gleichmäßige Spannung in einem rechteckigen Querschnitt zu erzielen, lässt sich ein möglichst flaches Strömungsprofil erreichen, indem die Kanäle so ausgelegt werden, dass ihre Höhe deutlich geringer ist als ihre Breite [14]. Die physiologische Scherspannung für Hirnkapillaren beträgt 0,3–2 Pa [2].

Transendothelialer elektrischer Widerstand (TEER)

Der TEER beschreibt den Widerstand über eine Zellbarriere hinweg und wird häufig als Validierungsparameter verwendet, um zu überprüfen, ob Endothelzellen in BBB-Modellen Tight-Junction-Komplexe bilden [15]. Wenn die Endothelzellen ordnungsgemäß wachsen und Tight Junctions zu benachbarten Zellen bilden, werden die interzellulären Zwischenräume der Zellschicht verschlossen und der Stromfluss durch diese wird eingeschränkt [16]. Dies führt zu einem höheren Stromwiderstand, was sich in höheren TEER-Werten widerspiegelt. TEER wird häufig, wie im Folgenden dargestellt, normiert auf die Membranfläche in der Einheit^Ωcm² angegeben, um einen direkten Vergleich mit anderen Modellen zu erleichtern.

𝑇𝐸𝐸𝑅 (Ω^𝑐𝑚²) = 𝑅𝑒𝑠𝑖𝑠𝑡𝑎𝑛𝑐𝑒 (Ω) × 𝐶𝑒𝑙𝑙 𝑐𝑢𝑙𝑡𝑢𝑟𝑒 𝑎𝑟𝑒𝑎 (^𝑐𝑚²)

In On-Chip-Modellen der Blut-Hirn-Schranke (BHS) ist die Messung des TEER eine schnelle, nicht-invasive Methode, die eine Echtzeit-Bewertung der Barrierequalität ermöglicht. Die Messungen erfolgen, indem ein schwacher elektrischer Strom über die Zellschicht geleitet wird, während gemessen wird, inwieweit der Strom durch die Zellschicht behindert wird. Organ-on-Chip-Geräte eignen sich für die Integration von Sensoren, mit denen der TEER in Echtzeit überwacht werden kann, was bei anderen Gerätetypen schwierig ist. In-vitro-Modelleder Blut-Hirn-Schranke müssen TEER-Werte von über 150–200^Ωcm²erreichen, um als akzeptable Modelle zu gelten [19]. Dies ist etwa um den Faktor zehn niedriger als die berichtetenIn-vivo-Ergebnisse. Der Grund dafür, dass ein deutlich niedrigerer TEER-Wert akzeptiert wird, liegt in den vereinfachten Bedingungenin vitro.

Permeabilität von „Blood-Brain-Barrier-on-Chip“-Modellen

„Organ-on-Chip“-Modelle können direkte Informationen über die Barrierefunktion liefern, indem sie die Permeabilität der Barriere gegenüber verschiedenen Substanzen untersuchen. Es ist sinnvoll, die Permeabilität so zu quantifizieren, dass sie leicht mit In-vivo-Daten verglichen werden kann. Der passive Transport durch die Barriere lässt sich anhand des Permeabilitätskoeffizienten eines durch den Chip strömenden Analyten quantifizieren. Es ist zu beachten, dass neben der Diffusion auch andere Faktoren zum Transport beitragen können, wie beispielsweise konvektive Strömung bei Lücken in der Zellbarriere und osmotische Strömung aufgrund unterschiedlicher Konzentrationen der gelösten Stoffe in den Kanälen. Dies lässt sich vermeiden, indem die Konzentration der gelösten Stoffe in den Kanälen kontrolliert wird und während der Experimente in beiden Kanälen der gleiche Druck herrscht. Da der Transport hydrophiler Verbindungen durch die Barriere sehr eingeschränkt ist, werden für Permeabilitätsuntersuchungen häufig solche Verbindungen verwendet, die mit fluoreszierenden Markern markiert sind. Die Permeabilität lässt sich dann mit einem Fluoreszenzmikroskop sichtbar machen.

Verfasst von Emma Thomée, Doktorandin im Rahmen des MAMI-Projekts, das durch das Forschungs- und Innovationsprogramm „Horizont 2020“ der Europäischen Union unter der Fördervereinbarung Nr. 766007 finanziert wird.

Literaturverzeichnis

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