Die Suche nach ultra-transparenten Materialien für die Herstellung mikrofluidischer Chips ist kein Zufall. Die hohe Transparenz dieser Materialien eignet sich hervorragend für die Mikroskopie, insbesondere für biologische Anwendungen. In dieser kurzen Übersicht präsentiert unser Expertenteam ein einfaches Protokoll zur Anfärbung von Zellen in Chips. Dieses Protokoll eignet sich ebenfalls hervorragend für Sphäroide und Organoide.
Man könnte meinen, dass es für die Anfärbung von Zellen, die in einem mikrofluidischen Chip kultiviert wurden, ausreicht, diese vor dem Laden auf den Chip zu färben. Dies ist jedoch nicht immer möglich, wenn der verwendete Farbstoff für die Zellen toxisch ist. In anderen Fällen möchte man frisch gebildete Zellen oder Gewebe anfärben. Daher ist es unerlässlich, die wichtigsten Schritte zu kennen, um eine erfolgreiche Markierung der Zellen zu gewährleisten.
Ein wesentlicher Schritt vor der eigentlichen Anfärbung ist der Phasenwechsel. Dieser besteht darin, die Öl- und Tensidschicht auf der Oberfläche der Tröpfchen zu entfernen, um ein anderes Fluid (z. B. einen Wirkstoff oder eine Farblösung) einzubringen.
Protokoll für den Phasenwechsel auf dem Chip
Material
- 20% PFO in HFE7500-Lösung zur Destabilisierung des Tensids (Es kann eine 50%ige PFO-Lösung in HFE7500 verwendet werden, wenn das Öl im Chip einen hohen Tensidanteil (>1%) aufweist)
- Ölspritze
- Mischlösung für die Anfärbung (siehe folgenden Abschnitt)
Perfusion mit Öl
ZWECK: Verringerung der Tensidkonzentration durch Verdünnung
- Auslass der Kammer abtrennen
- Ölspritze anschließen und dabei Luftblasen vermeiden
- Einlässe (Kammer, Junction und Zellen) abtrennen und tube für die Auslässe anschließen
- Etwa 500 µL Öl (oder mehr) injizieren (bei mittlerer Flussrate, d. h. ca. 100 µL/min)
Perfusion von PFO 20% in HFE7500
ZWECK: Destabilisierung des Tensids
- Ölspritze entfernen
- Schließen Sie die PFO-Spritze an
- Injizieren Sie etwa 300–400 µL PFO (bei mittlerer Flussrate, d. h. ca. 100 µL/min)
Perfusion der wässrigen Phase
In unserem Fall handelt es sich hierbei um Lösungen zur Markierung der Zellen gemäß dem folgenden Protokoll.
Für alle Schritte des Anschließens und Abfrontierens empfiehlt Ihnen das Team von Darwin Microfluidics die Verwendung von Ventilen und einem Luftblasenfänger, um dieses Protokoll zu erleichtern. Alle Produkte von Darwin Microfluidics finden Sie direkt hier.
Färbung von in einem mikrofluidischen Chip kultivierten Zellen
Material
- 4 % Paraformaldehyd-Lösung (oder PFA) zur Fixierung der Zellen
- Triton-X100-Lösung zur Permeabilisierung der Zellen (1 % in PBS)
- Lösung aus 1 % BSA und 5 % FBS in PBS
- Phosphatgepufferte Salzlösung (oder PBS) zum Waschen
- Farbstoff- oder Antikörperlösung zur Anfärbung der Zellen
Fixierung der Zellen
ZWECK: PFA stoppt zelluläre Reaktionen und erhält deren biologischen Zustand (Morphologie, Zellzyklus usw.)
- Schließen Sie die 4%ige PFA-Spritze an (ca. 160 µl)
- 20 Minuten Inkubationszeit einhalten (nach Abschluss der Infusion)
- Mit PBS waschen (ca. 160 µl)
Permeabilisierung der Zellen
ZWECK: Vergrößerung der Poren der Zellmembran, um die Aufnahme von Farbstoffen zu erleichtern. Triton X-100 ist ein Detergens, das die Lipide der Zellmembran angreift
- Schließen Sie die 1%ige Triton-Spritze an (ca. 160 µl)
- 5 Minuten Inkubationszeit einhalten
- Mit PBS waschen (ca. 160 µl)
Blockierung unspezifischer Bindungsstellen
ZWECK: Das BSA (in der FBS-Lösung) geht Komplexe mit Proteinen ein, um kompetitive Wechselwirkungen zwischen Proteinen und Markern zu fördern
- Perfusion von 1 % BSA in 5 % FBS in PBS (ca. 160 µl)
- 60 Minuten Inkubation (nicht streng)
- Mit PBS waschen (ca. 160 µl)
Farbstofffixierung
ZWECK: Dies ist der letzte Schritt der Färbung. Dieser Schritt muss im Dunkeln durchgeführt werden !
Zahlreiche Marker sind auf dem Markt erhältlich und können unabhängig von Ihrer Anwendung jeden Bedarf decken. In diesem Schritt nehmen wir die gängigsten Marker als Beispiele.
> Antikörper I Anti-Cadherin E und Antikörper II Anti-Goat [488] zur Darstellung von Zell-Zell-Kontakten in Grün (verdünnt in BSA-FBS-Lösung)
> Phalloidin wird zur Darstellung des polymerisierten Aktins in Rot verwendet (verdünnt in BSA-FBS-Lösung)
- Perfusion von Antikörper I Anti-Cadherin E, 1:1000 verdünnt in BSA-FBS-Lösung (ca. 160 µl)
- Inkubation 60 Min.
- Mit PBS waschen (ca. 160 µl)
- Perfusion von Antikörper II Anti-Goat [488], 1:1000 verdünnt in BSA-FBS-Lösung (ca. 160 µl)
- Inkubation 60 Min.
- Mit PBS waschen (ca. 160 µl)
- Perfusion von Phalloidin, 1:2000 verdünnt in BSA-FBS-Lösung (ca. 160 µl)
- Inkubation 30 Min.
- Mit PBS waschen (ca. 160 µl)
Beachten Sie, dass die Verdünnungen gemäß dem Protokoll des Herstellers vorgenommen werden.
Um Ihre Lösungen einfach zu handhaben, empfehlen die Experten von Darwin Microfluidics die Verwendung von Gestellen und mikrofluidischen Reservoirs für Eppendorf-Tubes. Das vollständige Sortiment an Tanks und Reservoirs von Darwin Microfluidics finden Sie direkt hier.
