Die Suche nach hochtransparenten Materialien für die Herstellung von Mikrofluidik-Chips ist kein Zufall. Die hohe Transparenz der Materialien eignet sich sehr gut für die Mikroskopie, insbesondere für biologische Anwendungen. In diesem kurzen Überblick stellt unser Expertenteam ein einfaches Protokoll zur Färbung von Zellen in Chips vor. Dieses Protokoll eignet sich auch sehr gut für Sphäroide und Organoide.
Man könnte meinen, dass man zur Färbung von Zellen, die in einem Mikrofluidik-Chip kultiviert werden, diese lediglich färben muss, bevor sie auf den Chip aufgebracht werden. Dies ist jedoch nicht immer möglich, wenn der zu verwendende Farbstoff für die Zellen toxisch ist. In anderen Fällen möchte man neu gebildete Zellen oder Gewebe färben. Daher ist es notwendig, die wichtigsten Schritte zu kennen, die zu einer erfolgreichen Zellmarkierung führen.
Ein wesentlicher Schritt vor der Färbung ist der Phasenwechsel. Beim Phasenwechsel wird die auf der Oberfläche der Tröpfchen vorhandene Öl- und Tensidschicht entfernt, um eine andere Flüssigkeit (beispielsweise einen Wirkstoff oder eine Färbelösung) aufzubringen.
On-Chip-Protokoll für Phasenwechsel
Material
- 20 %ige PFO-Lösung in HFE7500 zur Destabilisierung des Tensids (Es ist möglich, eine 50 %ige PFO-Lösung in HFE7500 zu verwenden, wenn das Öl im Chip einen hohen Tensidanteil (>1 %) aufweist.)
- Ölspritze
- Lösung für die Färbung anmischen (siehe den folgenden Abschnitt)
Perfusion mit Öl
ZIEL: Verringerung der Tensidkonzentration durch Verdünnung
- Den Kammerauslass abkoppeln
- Schließen Sie die Ölspritze an, ohne dass Luftblasen entstehen.
- Trennen Sie die Einlässe (Kammer, Verbindungsstück und Zellen) und schließen Sie die Auslässe an tube an.
- Führen Sie etwa 500 µL Öl (oder mehr) ein (bei mittlerer Durchflussrate, d. h. etwa 100 µL/min)
Perfusion von PFO 20 % in HFE7500
ZIEL: Das Tensid destabilisieren
- Entfernen Sie die Ölspritze
- Schließen Sie die PFO-Spritze an
- Injizieren Sie etwa 300–400 µL PFO (bei mittlerer Durchflussrate, d. h. etwa 100 µL/min)
Perfusion der wässrigen Phase
In unserem Fall handelt es sich dabei um Lösungen zur Markierung der Zellen nach dem folgenden Protokoll.
Für alle Phasen des Anschließen und Trennens empfiehlt das Team von Darwin Microfluidics die Verwendung von Ventilen und einem Luftblasenabscheider, um die Umsetzung dieses Verfahrens zu erleichtern. Alle Produkte von Darwin Microfluidics finden Siehier.
Färbung von Zellen, die auf einem Mikrofluidik-Chip kultiviert wurden
Material
- 4-prozentige Paraformaldehyd-Lösung (oder PFA) zur Fixierung von Zellen
- Triton x100-Lösung zur Permeabilisierung von Zellen (1 %ige Lösung in PBS)
- 1 % BSA in 5 % FBS in PBS-Lösung
- Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (oder PBS) zum Waschen
- Farbstoff- oder Antikörperlösung zum Anfärben von Zellen
Fixierung von Zellen
ZWECK: PFA ermöglicht es, die Zellreaktionen zu stoppen und ihren biologischen Zustand (Form, Zellzyklus, …) zu erhalten.
- Die Spritze mit 4-prozentiger PFA-Lösung (ca. 160 µl) anschließen
- Eine Inkubationszeit von 20 Minuten einhalten (nach Beendigung der Infusion)
- Mit PBS (ca. 160 µl) waschen
Permeabilisierung von Zellen
ZIEL: Vergrößerung der Porengröße der Zellmembran, um den Eintritt von Farbstoffen zu fördern. Triton X-100 ist ein Tensid, das in der Lage ist, die Lipide der Zellmembran anzugreifen
- Die Triton-1%-Spritze anschließen (ca. 160 µl)
- 5 Minuten Inkubationszeit einhalten
- Mit PBS (ca. 160 µl) waschen
Blockierung unspezifischer Bindungsstellen
ZWECK: Das BSA (in FBS-Lösung) bildet Komplexe mit Proteinen, um kompetitive Wechselwirkungen zwischen Proteinen und Markern zu fördern.
- Perfusion mit 1 % BSA in 5 % FBS in PBS (ca. 160 µl)
- Inkubation 60 min (nicht zwingend)
- Mit PBS (ca. 160 µl) waschen
Farbstofffixierung
ZWECK: Dies ist der letzte Schritt der Färbung. Dieser Schritt muss im Dunkeln durchgeführt werden!
Auf dem Markt sind zahlreiche Marker erhältlich, die allen Ihren Anforderungen gerecht werden, ganz gleich, für welchen Anwendungszweck Sie sie benötigen. In diesem Schritt stellen wir Ihnen die gängigsten Marker als Beispiele vor.
> Antikörper I gegen Cadherin E und Antikörper II gegen Ziegen [488] zur Darstellung der Zell-Zell-Verbindungen in Grün (verdünnt in einer BSA-FBS-Lösung)
> Phalloidin wird verwendet, um das polymerisierte Aktin rot anzuzeigen (verdünnt in einer BSA-FBS-Lösung)
- Perfusion mit Antikörper I (Anti-Cadherin E), verdünnt im Verhältnis 1:1000 in einer BSA-FBS-Lösung (ca. 160 µl)
- Inkubation 60 min
- Mit PBS (ca. 160 µl) waschen
- Perfusion mit Antikörper II gegen Ziegen [488], verdünnt im Verhältnis 1:1000 in einer BSA-FBS-Lösung (ca. 160 µl)
- Inkubation 60 min
- Mit PBS (ca. 160 µl) waschen
- Perfusion mit Phalloidin, verdünnt im Verhältnis 1:2000 in einer BSA-FBS-Lösung (ca. 160 µl)
- Inkubation 30 Min.
- Mit PBS (ca. 160 µl) waschen
Bitte beachten Sie, dass die Verdünnungen gemäß dem Protokoll des Lieferanten vorgenommen werden.
Um Ihre Lösungen einfach handhaben zu können, empfehlen Ihnen die Experten von Darwin Microfluidics die Verwendung von Tankgestellen und mikrofluidischen Reservoirs für Eppendorf-Röhrchen. Das gesamte Sortiment an Tanks und Reservoirs von Darwin Microfluidics finden Siehier.
