Die Leber spielt eine fundamentale Rolle bei Stoffwechselprozessen wie der Regulation des Blutzuckerspiegels, der Produktion von Plasmaproteinen, dem Arzneimittelstoffwechsel sowie der Galleproduktion [1][2] und weist morphologisch und funktionell eine komplexe Struktur auf [3].
Aufgrund ihrer Bedeutung wurde sie in den vergangenen Jahrzehnten intensiv untersucht, um die Mechanismen des Arzneimittelstoffwechsels und der Toxizität (DILI – Drug-Induced Liver Injury) sowie Lebererkrankungen wie Hepatitis, Zirrhose, Fibrose und Krebs zu verstehen [4][5][6].
Kurze Übersicht über die Struktur der Leberazinus
Die Pfortader (aus dem Darm) und die Leberarterie leiten das Blut zur Leber, wo es in Kapillaren, den sogenannten Sinusoiden, vermischt und in der Lebervene gesammelt wird, über die es zum Herzen zurücktransportiert wird.
Die Leber besteht aus sich wiederholenden Einheiten, den Lobuli (Läppchen) mit hexagonaler Form, die sich aus Hepatozyten (HCs) zusammensetzen, welche in Stränge um die Sinusoide herum angeordnet sind, getrennt durch einen perisinusoidalen Raum, den Dissschen Raum.
Die Hepatozyten sind die parenchymalen Leberzellen, die hauptsächlich an der Protein- und Gallensynthese sowie am Leberstoffwechsel beteiligt sind, während zu den wichtigsten nicht-parenchymalem Zellen (NPCs) die Leber-Sinusendothelzellen (LSECs), die Kupffer-Zellen (Makrophagen) und die Ito-Zellen (Sternzellen) gehören. Hepatozyten erhalten Nährstoffe von den Sinusendothelzellen durch Austauschprozesse über den Dissschen Raum [2] [7][8].
In-vitro-Modelle einer künstlichen Leber
Ein Liver-on-a-Chip-Modell: Das künstliche Lebersinusoid
An dieser Stelle haben wir uns entschlossen, das von Lee et al. entwickelte künstliche Lebersinusoid zu beschreiben, die eine mikrofluidische Plattform entworfen haben, welche eine physiologische Mikroumgebung (Massentransportbedingungen) für die Aussaat primärer Hepatozyten nachbilden kann [11].
Details zum Chip-Design
Die mikrofluidische Plattform bestand aus einem Kanal für den Fluss von Nährstoffen und Wirkstoffen sowie einer Zellkammer für die Aussaat dicht gepackter Hepatozyten.
Tatsächlich wurde nachgewiesen, dass hohe Dichten von Primärzellen die Ausbildung von Zell-Zell-Interaktionen mit gesteigerter Viabilität und metabolischer Aktivität ermöglichen.
Eine permeable endothelähnliche Barriere mit sinusoidaler Form, die aus einer Reihe paralleler Mikrokanäle besteht, wurde in das Chip-Design integriert, um (i) hohe Scherspannungen zu verhindern, die für die Hepatozyten (HCs) schädlich sein können, und (ii) die HCs im Zellbereich zu kompaktieren.
Wie baut man ein Liver-on-a-Chip?
Mikrofabrikation des Chips
SU-8 (ein Negativresist) wurde mittels Photolithographie in zwei Schritten auf einem Siliziumwafer strukturiert: Eine 1 µm dicke SU-8-Schicht wurde im Spin-Coating-Verfahren aufgetragen, um die Kanäle der endothelähnlichen Barriere zu erzeugen, gefolgt von einer 30 µm dicken SU-8-Schicht zur Erzeugung der Kanäle für den Fluss und die Zellaussaat.
Anschliessend wurden Polydimethylsiloxan-Chips (PDMS) vom SU-8-Master abgeformt und auf einen Objektträger gebondet.
Auslegung der Chip-Parameter zur Nachahmung der Lebermikrozirkulation
Der Chip wurde so konzipiert, dass ein volumetrischer Nährstofffluss von 100 pL/s (für ca. 250 im Zellbereich geladene Hepatozyten) gewährleistet ist, wie er typisch für die Lebermikrozirkulation ist. Dazu wurden die Kanalbreite, -höhe und -länge für den Strömungskanal auf (50 x 30 x 1200) µm und für die permeable Barriere auf (2 x 1 x 30) µm festgelegt.
Durch einen Barrieriermühlen-Querschnitt von 2 x 1 µm wurde ein geringer konvektiver Fluss und somit ein hoher fluidischer Gesamtwiderstand (1000-mal höher als im Fluidkanal) sichergestellt, wodurch ein diffuser Transport ermöglicht wurde. Auf diese Weise waren die Hepatozyten geringen Scherspannungen ausgesetzt und konnten Nährstoffe durch Diffusion über die Barriere hinweg aufnehmen.
Auslegung der Chip-Parameter zur Steuerung der Beladung dicht gepackter Hepatozyten
Das Design der endothelähnlichen Barriere ermöglichte zudem das Beladen mit einer hohen Dichte von Hepatozyten, ohne diese oder die Barriere selbst zu beschädigen.
Es wurde verifiziert, dass der schmale Querschnitt der Kanäle die Verformung der Zellmembran an der Grenzfläche reduziert.
Somit lenkte eine positive Strömung die Zellen ohne Verstopfung zum Boden des Zellbereichs, was zu einer hohen Zelldichte führte. Darüber hinaus führte ein durch die Zellen erzeugter ansteigender Widerstand zu einer Verringerung der Beladungsrate am Ende des Aussaatprozesses.
Mikrofluidischer Chip für die Primärzellkultur: Ergebnisse und Schlussfolgerung
Sowohl Ratten- als auch menschliche Primärhepatozyten wurden in den Zellbereich eingebracht, und die Zellviabilität wurde über einen Zeitraum von bis zu 7 Tagen bewertet.
Die mikrofluidische Plattform wurde kontinuierlich mit Kulturmedium perfundiert. Die Ergebnisse zeigten, dass beide Zelllinien ihre Viabilität nach 7 Tagen ohne die Notwendigkeit einer Kollgenbeschichtung (die in statischen Kultursystemen erforderlich ist) beibehielten.
Darüber hinaus sorgte die hohe Zelldichte aufgrund der Zell-Zell-Kontakte für eine hohe metabolische Aktivität.
Der Übersichtsartikel zeigt, wie mikrofluidische Plattformen so konstruiert werden können, dass sie spezifische Funktionen eines Gewebes oder Organs detailgetreu nachbilden. In dieser Arbeit wurde ein mikrofluidisches Gerät, bestehend aus einem Strömungskanal, einem Zellbereich und einer permeablen endothelähnlichen Barriere, entwickelt, um die Bedingungen der Lebermikrozirkulation zu imitieren und so die Viabilität der Hepatozyten sowie die Zell-Zell-Interaktionen zu verbessern.
Übersichtsartikel verfasst von Alessandra Dellaquila.
Literaturverzeichnis
[1] Y. B. Kang et al., „Liver sinusoid on a chip: Long‑term layered co‑culture of primary rat hepatocytes and endothelial cells in microfluidic platforms,“ Biotechnol. Bioeng., Bd. 112, Nr. 12, S. 2571–2582, 2015.
[2] C. H. Beckwitt et al., „liver „organ on a chip“,“ Exp. Cell Res., 2017.
[3] Y. Du et al., „Mimicking liver sinusoidal structures and functions using a 3D-configured microfluidic chip,“ Lab Chip, Bd. 17, Nr. 5, S. 782–794, 2017.
[4] L. A. Vernetti et al., „A human liver microphysiology platform for investigating physiology, drug safety, and disease models,“ Exp. Biol. Med., Bd. 241, Nr. 1, S. 101–114, 2016.
[5] V. Natarajan, E. N. Harris und S. Kidambi, „SECs (sinusoidal endothelial cells), liver microenvironment, and fibrosis,“ Biomed Res. Int., Bd. 2017, 2017.
[6] S. S. Bale et al., „In vitro platforms for evaluating liver toxicity,“ Exp. Biol. Med., Bd. 239, Nr. 9, S. 1180–1191, 2014.
[7] A. J. Strain und J. M. Neuberger, „A bioartificial liver–state of the art,“ Science (80-. )., Bd. 295, Nr. 5557, S. 1005–1009, 2002.
[8] C. Moraes, G. Mehta, S. C. Lesher-Perez und S. Takayama, Organs-on-a-Chip: A Focus on Compartmentalized Microdevices, Bd. 40. 2011.
[9] H. Tsutsui und S. Nishiguchi, Importance of Kupffer Cells in the Development of Acute Liver Injuries in Mice, Bd. 15. 2014.
[10] G. H. Underhill und S. R. Khetani, „Bioengineered Liver Models for Drug Testing and Cell Differentiation Studies,“ Cell. Mol. Gastroenterol. Hepatol., Bd. 5, Nr. 3, S. 426–439, 2018.
[11] P. J. Lee, P. J. Hung und L. P. Lee, „An artificial liver sinusoid with a microfluidic endothelial‐like barrier for primary hepatocyte culture,“ Biotechnol. Bioeng., Bd. 97, Nr. 5, S. 1340–1346, 2007.
