Die Leber spielt eine grundlegende Rolle bei Stoffwechselvorgängen wie der Regulierung des Blutzuckerspiegels, der Bildung von Plasmaproteinen, dem Arzneimittelstoffwechsel und der Gallenbildung [1][2] und weist sowohl in morphologischer als auch in funktioneller Hinsicht eine komplexe Struktur auf [3].
Aufgrund seiner Bedeutung wurde es in den vergangenen Jahrzehnten intensiv erforscht, um die Mechanismen des Arzneimittelstoffwechsels und der Arzneimitteltoxizität (DILI – Drug-Induced Liver Injury) sowie von Lebererkrankungen wie Hepatitis, Leberzirrhose, Fibrose und Leberkrebs zu verstehen [4][5][6].
Kurzer Überblick über den Aufbau der Lebersinusiden
Die Pfortader (aus dem Darm) und die Leberarterie leiten das Blut zur Leber, wo es sich in den sogenannten Sinusoiden, einer Art Kapillaren, vermischt und in der zentralen Lebervene gesammelt wird, über die es dann zum Herzen zurückgeführt wird.
Die Leber besteht aus sich wiederholenden Einheiten, den Läppchen, die eine sechseckige Form haben und aus Hepatozyten (HCs) bestehen, die in Strangstrukturen um die Sinusoide angeordnet sind und durch einen perisinusoidalen Raum, den Disse-Raum, voneinander getrennt sind.
Die Hepatozyten sind die parenchymalen Leberzellen, die hauptsächlich an der Protein- und Gallensynthese sowie am Leberstoffwechsel beteiligt sind, während die wichtigsten nicht-parenchymalen (NPC) Zellen die sinusoidalen Endothelzellen der Leber (LSECs), die Kupffer-Zellen (Makrophagen) und die Sternzellen sind. Die Hepatozyten erhalten ihre Nährstoffe von den sinusoidalen Zellen über den Austausch durch den Disse-Raum [2] [7][8].
In-vitro-Modelle der künstlich hergestellten Leber
Ein „Leber-auf-einem-Chip“-Modell: Die künstliche Lebersinuside
Wir haben uns entschlossen, hier die von Lee et al. entwickelte künstliche Lebersinuside zu beschreiben. Diese haben eine mikrofluidische Plattform konzipiert, mit der sich ein physiologisches Mikromilieu (Stofftransportbedingungen) für die Besiedlung mit primären Hepatozyten nachbilden lässt [11].
Einzelheiten zum Chipdesign
Die mikrofluidische Plattform bestand aus einem Kanal für den Durchfluss von Nährstoffen und Wirkstoffen sowie einem Zellkompartiment für die Aussaat dicht gepackter Hepatozyten.
Tatsächlich wurde nachgewiesen, dass hohe Dichten an Primärzellen die Bildung von Zell-Zell-Interaktionen mit erhöhter Lebensfähigkeit und Stoffwechselaktivität ermöglichen.
Eine durchlässige, endothelähnliche Barriere mit sinusförmiger Struktur, bestehend aus einer Anordnung paralleler Mikrokanäle, wurde in das Chip-Design integriert, um (i) hohe Scherkräfte zu vermeiden, die für die HCs gefährlich sein können, und (ii) die HCs im Zellbereich dicht anzuordnen.
Wie stellt man eine Leber auf einem Chip her?
Mikrofabrikation von Chips
SU-8 (ein negativer Fotolack) wurde mittels Photolithografie in zwei Schritten auf einem Siliziumwafer strukturiert: Zunächst wurde eine 1 µm dicke SU-8-Schicht im Spin-Coating-Verfahren aufgetragen, um die Kanäle der endothelähnlichen Barriere zu erzeugen; anschließend wurde eine 30 µm dicke SU-8-Schicht verwendet, um die Kanäle für den Durchfluss und die Zellbesiedlung zu schaffen.
Anschließend wurde Polydimethylsiloxan (PDMS) wurden aus der SU-8-Form repliziert und auf einen Objektträger geklebt.
Auslegung der Chip-Parameter zur Nachbildung der Mikrozirkulation in der Leber
Der Chip wurde so konzipiert, dass ein volumetrischer Nährstoffdurchfluss von 100 pL/s (bei etwa 250 im Zellbereich eingebrachten Hepatozyten) gewährleistet ist, wie er für die Mikrozirkulation in der Leber typisch ist. Zu diesem Zweck wurden die Breite, Höhe und Länge der Kanäle auf (50 × 30 × 1200) µm bzw. (2 × 1 × 30) µm für den Durchflusskanal und die durchlässige Barriere festgelegt.
Durch die Verwendung eines Barrierekanals mit einem Querschnitt von 2 × 1 µm wurde eine geringe konvektive Strömung und damit ein hoher Gesamtfluidwiderstand (1000-mal höher als im Fluidkanal) gewährleistet, wodurch ein diffusionsgesteuerter Transport ermöglicht wurde. Auf diese Weise wurden die HCs geringen Scherkräften ausgesetzt und konnten Nährstoffe durch Diffusion über die Barriere aufnehmen.
Auslegung der Chip-Parameter zur Steuerung der Belastung dicht gepackter Hepatozyten
Die Konstruktion der endothelähnlichen Barriere ermöglichte zudem das Einbringen einer hohen Dichte an HCs, ohne diese oder die Barriere selbst zu beschädigen.
Es wurde nachgewiesen, dass der schmale Querschnitt der Kanäle die Verformung der Zellmembran an der Grenzfläche verringert.
So lenkte eine positive Strömung die Zellen ohne Verstopfung zum Boden des Zellbereichs, was zu einer hohen Zellpackungsdichte führte. Darüber hinaus führte ein durch die Zellen erzeugter steigender Widerstand zu einer Verringerung der Beladungsrate am Ende des Aussaatprozesses.
Mikrofluidik-Chip für die Primärzellkultur: Ergebnisse und Schlussfolgerung
Sowohl primäre Hepatozyten der Ratte als auch des Menschen wurden in den Zellbereich eingebracht, und die Zellviabilität wurde über einen Zeitraum von bis zu 7 Tagen untersucht.
Die mikrofluidische Plattform wurde kontinuierlich mit Kulturmedium durchspült. Die Ergebnisse zeigten, dass beide Zelllinien ihre Viabilität auch nach 7 Tagen beibehielten, ohne dass eine Kollagenbeschichtung erforderlich war (die in statischen Kultursystemen notwendig ist).
Zudem sorgte die hohe Zelldichte aufgrund der Zell-Zell-Kontakte für eine hohe Stoffwechselaktivität.
Die Übersicht zeigt, wie mikrofluidische Plattformen so konzipiert werden können, dass sie bestimmte Funktionen eines Gewebes oder Organs genau nachahmen. In dieser Arbeit wurde ein mikrofluidisches System entwickelt, das aus einem Strömungskanal, einem Zellbereich und einer durchlässigen, endothelartigen Barriere besteht und die Bedingungen der Lebermikrozirkulation nachbildet, wodurch die Lebensfähigkeit der Hepatozyten und die Zell-Zell-Interaktionen verbessert werden.
Rezension verfasst von Alessandra Dellaquila.
Literaturverzeichnis
[1] Y. B. Kang et al., „Leber-Sinusoid auf einem Chip: Langfristige geschichtete Kokultur von primären Rattenhepatocyten und Endothelzellen in mikrofluidischen Plattformen“, Biotechnol. Bioeng., Band 112, Nr. 12, S. 2571–2582, 2015.
[2] C. H. Beckwitt et al., „Leber als ‚Organ auf einem Chip‘“, Exp. Cell Res., 2017.
[3] Y. Du et al., „Nachbildung der Strukturen und Funktionen der Lebersinusolen mithilfe eines mikrofluidischen Chips in 3D-Konfiguration“, Lab Chip, Bd. 17, Nr. 5, S. 782–794, 2017.
[4] L. A. Vernetti et al., „Eine Plattform zur Mikrophysiologie der menschlichen Leber zur Untersuchung von Physiologie, Arzneimittelsicherheit und Krankheitsmodellen“, Exp. Biol. Med., Bd. 241, Nr. 1, S. 101–114, 2016.
[5] V. Natarajan, E. N. Harris und S. Kidambi, „SECs (sinusoidale Endothelzellen), die Mikroumgebung der Leber und Fibrose“, Biomed Res. Int., Bd. 2017, 2017.
[6] S. S. Bale et al., „In-vitro-Plattformen zur Bewertung der Lebertoxizität“, Exp. Biol. Med., Bd. 239, Nr. 9, S. 1180–1191, 2014.
[7] A. J. Strain und J. M. Neuberger, „A bioartificial liver – state of the art“, Science (80-. ), Band 295, Nr. 5557, S. 1005–1009, 2002.
[8] C. Moraes, G. Mehta, S. C. Lesher-Perez und S. Takayama, „Organs-on-a-Chip: Ein Schwerpunkt auf kompartimentierten Mikrovorrichtungen“, Band 40, 2011.
[9] H. Tsutsui und S. Nishiguchi, „Die Bedeutung von Kupffer-Zellen bei der Entstehung akuter Leberschäden bei Mäusen“, Band 15, 2014.
[10] G. H. Underhill und S. R. Khetani, „Bioengineered Liver Models for Drug Testing and Cell Differentiation Studies“, Cell. Mol. Gastroenterol. Hepatol., Bd. 5, Nr. 3, S. 426–439, 2018.
[11] P. J. Lee, P. J. Hung und L. P. Lee, „Eine künstliche Lebersinuside mit einer mikrofluidischen, endothelähnlichen Barriere für die Kultur primärer Hepatozyten“, Biotechnol. Bioeng., Band 97, Nr. 5, S. 1340–1346, 2007.
