Liposomen oder Lipid-nanopartikel sind geschlossene Vesikel, die häufig zur verkapselung verschiedenster Moleküle wie DNA, Proteinen, Wirkstoffen und/oder anderen Chemikalien eingesetzt werden. In diesem kurzen Überblick diskutieren wir die gängigsten Herstellungsverfahren mit besonderem Schwerpunkt auf der Mikrofluidik.
Die Hülle eines Liposoms ist eine Phospholipiddoppelschicht, die als biomimetische Membran ein flüssiges Kompartiment umschließt, wie in Abb. 1 schematisch dargestellt. Dank ihrer extrem hohen Biokompatibilität finden Liposomen in verschiedenen Bereichen Anwendung, weshalb die Entwicklung robuster Herstellungsverfahren von großer Bedeutung ist.
Unabhängig vom Herstellungsverfahren handelt es sich bei Phospholipiden um amphiphile Moleküle, die sich aufgrund ihrer hydrophobie in wässrigen Lösungen spontan zu Liposomen anordnen. Dieser Prozess reduziert die ungünstigen Wechselwirkungen zwischen den hydrophoben Acylketten und der umgebenden wässrigen Phase.
Je nach spezifischem Herstellungsverfahren können Größe, Lamellarität und Dispersität der erhaltenen Liposomen stark variieren. Die für medizinische Anwendungen eingesetzten Lipidvesikel sind typischerweise unilamellar und weisen einen Durchmesser von ca. 100 nm auf.
Mikrofluidische Chips zur Liposomenherstellung
Die ältesten und traditionellen Methoden zur Herstellung von Liposomen bestehen aus den sogenannten makroskopischen oder Batch-Techniken, die auf der anfänglichen Dehydratisierung von Lipidfilmen gefolgt von einem Quellungsprozess und einer abschließenden mechanischen Behandlung basieren, um die in Wasser dispergierten Doppelschichten zu erzeugen. Diese Methoden zeichnen sich jedoch durch eine geringe Reproduzierbarkeit, eine eingeschränkte Prozesskontrolle sowie eine ineffiziente Nutzung von Materialien und Reagenzien aus.
Mikrofluidik wurde kürzlich als effizientes Verfahren zur Herstellung von Liposomen auf eine kontrollierte, reproduzierbare und hochdurchsatzfähige Weise untersucht. Die Mikrofluidik ermöglicht eine Reduzierung der verwendeten Volumina und der damit verbundenen Kosten, indem Fluide in geometrisch eingeschränkten Kompartimenten gehandhabt werden, die typischerweise durch mikrometrische Längenskalen und niedrige Reynolds-Zahlen gekennzeichnet sind.
Tropfengenerator
Das mikrofluidische Flow-Focusing ist eine der zuerst eingeführten Methoden und besteht in der Verwendung mikrofluidischer Chips mit Kreuzströmungsgeometrie, um das Aufeinandertreffen eines zentralen Stroms einer alkoholischen Lösung mit den Phospholipiden und einer wässrigen Lösung zu gewährleisten. Typischerweise verschmelzen drei Ströme im selben mikrofluidischen Kanal, wie in Abb. 2 dargestellt. Dies ist das typische Muster mikrofluidischer Geräte, die sich für die Generierung von Tröpfchen eignen (klicken Sie hier, um einige Beispiele zu sehen). Wie Sie sehen, wird eine alkoholische Phospholipidlösung in einen zentralen Kanal injiziert, der von zwei lateralen wässrigen Lösungen flankiert wird. Der lipidhaltige Strom wird fokussiert, und dank 1) der niedrigen Reynolds-Zahl und 2) der massentransferdominierten Diffusion diffundiert der Alkohol in die wässrige Lösung, wodurch seine Konzentration im zentralen Strom abzusinken beginnt. Sobald er eine kritische Konzentration unterhalb der Löslichkeit der Phospholipide erreicht, ordnen sich diese spontan im Wege der Selbstassemblierung zu Liposomen an. Das volumetrische Flussratenverhältnis zwischen dem Lipid- und dem Wasserphasenstrom sowie die Gesamtdurchflussrate beeinflussen die Größe der erhaltenen Liposomen, und deren Anpassung ermöglicht eine kontrollierte Herstellung.
Die doppelte Emulsion ist eine Variation der Flow-Focusing-Methode und besteht in der Erzeugung einer Wasser-in-Öl-in-Wasser-Emulsion, bei der im ersten Schritt eine organische Lösung aus Toluol und Chloroform zur Verdampfung der Ölphase verwendet wird. Sobald die Ölphase entfernt ist, kommen die Phospholipid-Monolayer, welche die internen und externen Öl-Wasser-Grenzflächen darstellen, mit der zweiten wässrigen Phase in Kontakt und lagern sich zu Liposomen zusammen.
Diese Methode ist technisch anspruchsvoll, da sie den Einsatz von zwei nacheinander geschalteten Chips erfordert, von denen der erste eine hydrophobe und der letztere eine hydrophile Beschichtung aufweist. Die Effizienz kann aufgrund des Emulgierschritts, während dessen Vesikelgröße und Herstellungsrate 1) deren Stabilität und 2) die Phospholipidkonzentration an den Öl-Wasser-Grenzflächen stark beeinflussen, ebenfalls gering sein. Wenn die Liposomen also zu klein sind oder sich zu schnell bilden und die Phospholipide an der Grenzfläche noch nicht stabilisiert sind, neigen die Tröpfchen dazu, leicht zu brechen und ihren Inhalt freizusetzen, was die Verkapselungseffizienz verringert.
Herringbone-Mischer
Kürzlich wurde das Mikromischen mittels der Herringbone-Methode untersucht, welche im Vergleich zu anderen Herstellungsverfahren erhebliche Vorteile hinsichtlich der Effizienz der Liposomenproduktion aufweist.
Beispielsweise wurden PEGylierte Liposomen erfolgreich unter Verwendung eines Herringbone-Mixers hergestellt (klicken Sie hier für weitere Informationen). Bei diesem Gerät handelt es sich um einen Mischer mit chaotischer Advektion, der in der Lage ist, die für Mikrokanäle typische laminare Strömung zu unterbrechen und die für den Liposomen-Herstellungsprozess benötigte Zeit zu verkürzen. Das spezifische Muster des Geräts, das aus fischgrätartigen Rillen (Herringbone-Grooves) besteht, verteilt die Fluide durch Erzeugung einer Querströmung im mikrokanal neu.
The vertices of the grooves are offset to approximately one third of the width of the channel and two counter-rotating vortices are created by the grooves. The subsequent set of herringbone groves with a mirrored orientation of the vortices allows the creation of a full mixing cycle as shown in Fig.3. The alternation of these herringbone sets reorients the flow periodically and strongly improves the mixing. This microfluidic preparation method allows the controlled creation of liposomes of different sizes (∼100 nm) and good dispersity (< 0.2). By changing the flow rate parameters and the formulations in terms of aqueous buffer, phospholipid concentrations, and composition it is possible to finely tune the production of liposomes with the desired features.
Abschließende Überlegungen
Es ist offensichtlich, dass die Mikrofluidik einen vorteil als Methode zur Herstellung von Liposomen für zahlreiche Anwendungsbereiche darstellt. Verglichen mit den traditionellen makroskopischen oder Batch-Methoden ermöglichen mikrofluidische Verfahren eine hochdurchsatzfähige Herstellung von Liposomen auf gut kontrollierte und reproduzierbare Weise. Obwohl die Fortschritte rasant waren, sind weitere Verbesserungen erforderlich, um die Mikrofluidik sowohl im Labor als auch in der Industrie als bevorzugte Methode für die Liposomenherstellung zu etablieren.
Derzeit stellen vor allem zwei Hindernisse die Etablierung der Mikrofluidik als bevorzugtes Verfahren zur Herstellung von Liposomen dar:
- Wie von Björnmalm et al. (2014) untersucht, ist es für in der Mikrofluidik unerfahrene Forscher schwierig, Zugang zu mikrofluidischen Technologien zu erhalten
- Carugo et al. (2016) und Sackmann et al. (2014) heben hingegen hervor, dass es an qualifizierter wissenschaftlicher Unterstützung darüber mangelt, wie die Mikrofluidik ihre spezifischen Anforderungen erfüllen kann
Glücklicherweise können die Verfügbarkeit einer wachsenden Zahl innovativer mikrofluidischer Geräte auf dem Markt und die auf Wissensaustausch ausgerichtete Haltung vieler erfahrener Mikrofluidik-Experten diese Lücke nun schließen und die Position der Mikrofluidik als bevorzugte Methode gegenüber herkömmlichen Verfahren festigen. Darwin Microfluidics hat sich dieser Revolution verschrieben. Wir bieten innovative mikrofluidische Geräte für die Liposomenpräparation und unser Team aus erfahrenen Wissenschaftlern und PhDs bietet die Unterstützung, die Forscher für den Erfolg ihrer Arbeiten benötigen.
Literaturverzeichnis
- Björnmalm M. et al., Engineering and evaluating drug delivery particles in microfluidic devices. Journal of Controlled Release 2014, 190: 139.
- Cheung C. C.L. et Al-Jamal W. T. Sterically stabilized liposomes production using staggered herringbone micromixer: Effect of lipid composition and PEG-lipid content. International Journal of Pharmaceutics 2019, 566: 687.
- Carugo D. et al., Liposome production by microfluidics: potential and limiting factors. Scientific Reports 2016, 6: 25876.
- Deshpande S. et Dekker C. On-chip microfluidic production of cell-sized liposomes. Nature protocols 2018, 13 (5): 856.
- Sackmann E.K. et al., The present and future role of microfluidics in biomedical research. Nature 2014, 507: 181.
- van Swaay D. et DeMello A. Microfluidic methods for forming liposomes. Lab on Chip 2013, 13: 752.
- Williams M. S. et al., A practical guide to the staggered herringbone mixer. Lab on chip 2008, 8 (7): 1121.
