Liposomen oder Lipidnanopartikel sind geschlossene Vesikel, die häufig zur Einkapselung verschiedener Moleküle wie DNA, Proteine, Wirkstoffe und/oder anderer chemischer Substanzen verwendet werden. In diesem kurzen Überblick werden wir die gängigsten Herstellungsverfahren mit besonderem Schwerpunkt auf der Mikrofluidik erörtern.
Eine Liposomenhülle ist eine Phospholipid-Doppelschicht, die als biomimetische Membran fungiert und einen flüssigen Innenraum umschließt, wie in Abb. 1 schematisch dargestellt. Dank ihrer extrem hohen Biokompatibilität finden Liposomen in verschiedenen Bereichen nützliche Anwendungen, weshalb die Entwicklung robuster Herstellungsverfahren von großer Bedeutung ist.
Unabhängig von den Herstellungsverfahren sind Phospholipide amphiphile Moleküle, die sich aufgrund ihrer Hydrophobie in wässrigen Lösungen spontan zu Liposomen organisieren. Dieser Prozess verringert die ungünstigen Wechselwirkungen zwischen den hydrophoben Acylketten und der umgebenden wässrigen Phase.
Je nach dem zur Herstellung von Liposomen verwendeten Verfahren können Größe, Lamellarität und Dispersität der erhaltenen Liposomen sehr unterschiedlich sein. Die in medizinischen Anwendungen verwendeten Lipidvesikel sind in der Regel unilamellar und haben einen Durchmesser von ~100 nm.
Mikrofluidik-Vorrichtungen zur Herstellung von Liposomen
Die ältesten und traditionellsten Verfahren zur Herstellung von Liposomen sind die sogenannten makroskaligen oder Chargenverfahren, die auf der anfänglichen Dehydratisierung von Lipidfilmen, dem anschließenden Quellvorgang und der abschließenden mechanischen Bearbeitung zur Erzeugung der wasserdispergierten Doppelschichten beruhen. Diese Verfahren zeichnen sich jedoch durch eine schlechte Reproduzierbarkeit, eine eingeschränkte Prozesskontrolle sowie eine ineffiziente Nutzung von Materialien und Reagenzien aus.
Die Mikrofluidik wurde in jüngster Zeit als effiziente Methode zur Herstellung von Liposomen unter kontrollierten, reproduzierbaren Bedingungen und mit hohem Durchsatz untersucht. Die Mikrofluidik ermöglicht eine Reduzierung der verwendeten Volumina und der damit verbundenen Kosten, indem Flüssigkeiten in geometrisch begrenzten Kammern gehandhabt werden, die typischerweise durch Längenskalen im Mikrometerbereich und niedrige Reynolds-Zahlen gekennzeichnet sind.
Tröpfchengenerator
Die mikrofluidische Strömungsfokussierung ist eine der ersten eingeführten Methoden und besteht in der Verwendung von Mikrofluidik-Chips mit einer Querstromgeometrie, um den Zusammenfluss eines zentralen Stroms einer alkoholischen Lösung, die die Phospholipide enthält, mit einer wässrigen Lösung sicherzustellen. Typischerweise vereinigen sich drei Ströme in demselben mikrofluidischen Kanal, wie in Abb. 2 dargestellt. Dies ist das typische Muster von mikrofluidischen Vorrichtungen, die zur Erzeugung von Tröpfchen geeignet sind (klicken Sie hier, um einige Beispiele zu sehen). Wie Sie sehen können, wird eine alkoholische Phospholipidlösung in einen zentralen Kanal injiziert, der von zwei seitlichen wässrigen Lösungen flankiert wird. Der lipidhaltige Strom wird fokussiert, und dank 1) der niedrigen Reynolds-Zahl und 2) der durch den Stofftransport dominierten Diffusion diffundiert der Alkohol in die wässrige Lösung, wodurch seine Konzentration im zentralen Strom abzunehmen beginnt. Sobald eine kritische Konzentration erreicht wird, die unterhalb der Löslichkeit der Phospholipide liegt, organisieren sich diese spontan durch Selbstorganisation zu Liposomen. Das Verhältnis der Volumenströme zwischen der Lipid- und der Wasserphase sowie der Gesamtstrom beeinflussen die Größe der erhaltenen Liposomen, und durch deren Anpassung lässt sich die Herstellung kontrolliert steuern.
Die Doppelemulsion ist eine Variante des Flow-Fokussierungsverfahrens und besteht in der Herstellung einer Wasser-in-Öl-in-Wasser-Emulsion, bei der im ersten Schritt eine organische Lösung aus Toluol und Chloroform zur Verdampfung der Ölphase verwendet wird. Sobald die Ölphase entfernt ist, kommen die Phospholipid-Monoschichten, die die inneren und äußeren Öl-Wasser-Grenzflächen bilden, mit der zweiten wässrigen Phase in Kontakt und lagern sich zu Liposomen zusammen.
Dieses Verfahren ist technisch anspruchsvoll, da es den Einsatz von zwei verschiedenen Chips erfordert, die hintereinander geschaltet sind und von denen der erste eine hydrophobe Beschichtung und der zweite eine hydrophile Beschichtung aufweist. Die Effizienz könnte zudem aufgrund des Emulgierungsschritts gering sein, bei dem die Vesikelgröße und die Herstellungsgeschwindigkeit einen starken Einfluss auf 1) deren Stabilität und 2) die Phospholipidkonzentration an den Öl-Wasser-Grenzflächen haben. Sind die Liposomen also zu klein oder bilden sie sich zu schnell, und sind die Phospholipide an der Grenzfläche noch nicht stabilisiert, neigen die Tröpfchen dazu, leicht zu zerbrechen und ihren Inhalt freizusetzen, was die Verkapselungseffizienz verringert.
Fischgräten-Mischer
In jüngster Zeit wurde das Mikromischen nach der Herringbone-Methode untersucht, das hinsichtlich der Effizienz der Liposomenherstellung große Vorteile gegenüber anderen Herstellungsverfahren aufweist.
So konnten beispielsweise PEGylierte Liposomen mithilfe eines Herringbone-Mischers erfolgreich hergestellt werden (klicken Sie hier für weitere Informationen). Bei diesem Gerät handelt es sich um einen chaotischen Advektionsmischer, der die für Mikrokanäle typische laminare Strömung aufbrechen und die für die Herstellung der Liposomen benötigte Zeit verkürzen kann. Das spezifische Muster des Geräts, das aus Fischgrätenrillen besteht, verteilt die Flüssigkeiten neu, indem es eine Querströmung im Mikrokanal erzeugt.
The vertices of the grooves are offset to approximately one third of the width of the channel and two counter-rotating vortices are created by the grooves. The subsequent set of herringbone groves with a mirrored orientation of the vortices allows the creation of a full mixing cycle as shown in Fig.3. The alternation of these herringbone sets reorients the flow periodically and strongly improves the mixing. This microfluidic preparation method allows the controlled creation of liposomes of different sizes (∼100 nm) and good dispersity (< 0.2). By changing the flow rate parameters and the formulations in terms of aqueous buffer, phospholipid concentrations, and composition it is possible to finely tune the production of liposomes with the desired features.
Abschließende Überlegungen
Es liegt auf der Hand, dass die Mikrofluidik als Verfahren zur Herstellung von Liposomen für zahlreiche AnwendungsbereicheVorteilebietet. Im Vergleich zu herkömmlichen makroskaligen oder Chargenverfahrenermöglichen mikrofluidische Verfahren eine hochdurchsatzfähige Herstellung von Liposomen auf gut kontrollierte und reproduzierbare Weise. Trotz der rasanten Fortschritte sind noch weitere Verbesserungen erforderlich, um die Mikrofluidik sowohl im Labor als auch in der Industrie als Verfahren der Wahl für die Herstellung von Liposomen zu etablieren.
Derzeit gibt es zwei wesentliche Hindernisse, die der Etablierung der Mikrofluidik als bevorzugte Methode zur Herstellung von Liposomen im Wege stehen:
- Wie Björnmalm et al. (2014) festgestellt haben,ist es für Forscher ohne Erfahrung im Bereich der Mikrofluidik schwierig, Zugang zu mikrofluidischen Technologien zu erhalten
- Carugo et al. (2016) und Sackmann et al. (2014) wiesen hingegen darauf hin,dass es an fundierten wissenschaftlichen Belegen dafür mangelt, wie die Mikrofluidik ihren spezifischen Anforderungen gerecht werden könnte.
Hoffentlich können die zunehmende Verfügbarkeit innovativer mikrofluidischer Geräte auf dem Markt und die Bereitschaft vieler erfahrener Mikrofluidik-Experten zum Wissensaustauschdiese Lückenunschließenund die Position der Mikrofluidik als bevorzugte Methode gegenüber herkömmlichen Verfahren festigen. Darwin Microfluidics hat sich dieser Revolution verschrieben. Wir bieten innovative mikrofluidische Geräte für die Liposomenherstellung an, und unser Team aus erfahrenen Wissenschaftlern sowie PhDs bietet die Unterstützung, die Forscher benötigen, um bei ihren Aktivitäten erfolgreich zu sein.
Literaturverzeichnis
- Björnmalm M. et al., Entwicklung und Bewertung von Partikeln zur Wirkstoffabgabe in mikrofluidischen Systemen. Journal of Controlled Release 2014, 190: 139.
- Cheung C. C.L. et al. – Jamal W. T. Herstellung sterisch stabilisierter Liposomen unter Verwendung eines versetzten Fischgräten-Mikromischers: Einfluss der Lipidzusammensetzung und des PEG-Lipidgehalts. International Journal of Pharmaceutics 2019, 566: 687.
- Carugo D. et al., Liposomenherstellung mittels Mikrofluidik: Potenzial und einschränkende Faktoren. Scientific Reports 2016, 6: 25876.
- Deshpande S.undDekker C. On-Chip-Mikrofluidik zur Herstellung von Liposomen in Zellgröße. Nature Protocols 2018, 13 (5): 856.
- Sackmann E.K. et al., Die gegenwärtige und zukünftige Rolle der Mikrofluidik in der biomedizinischen Forschung. Nature 2014, 507: 181.
- van Swaay, D.undDeMello, A. Mikrofluidische Verfahren zur Herstellung von Liposomen. Lab on Chip 2013, 13: 752.
- Williams M. S. et al., Ein praktischer Leitfaden zum versetzten Fischgrätenmischer. Lab on Chip 2008, 8 (7): 1121.
