Sphäroide sind in der Biologie dreidimensionale Zellaggregate, die die Architektur und Funktion von Geweben nachahmen. In Umgebungen, in denen eine Anhaftung an Oberflächen verhindert wird, können sich Zellen tatsächlich selbst zu kugelförmigen Strukturen, sogenannten Sphäroiden, zusammenlagern. Das Interesse an diesen Strukturen hat in den letzten Jahren zugenommen, da sie ein 3D-Modell darstellen, das der in-vivo-Mikroumgebung von Zellen in einem lebenden Organismus näher kommt als die klassische 2D-Zellkultur. Die 3D-Zellkultur bietet zahlreiche Vorteile für die medizinische Forschung, beispielsweise die Erstellung prädiktiverer Modelle zur Unterstützung der Entwicklung neuer Therapien.In diesem Blogartikel werden wir die Grundlagen der Bildung zellulärer Sphäroide beleuchten und uns eingehend mit ihren vielfältigen Anwendungsmöglichkeiten befassen.
Sphäroidbildung – Wie aggregieren Zellen?
Es gibt verschiedene Möglichkeiten, Sphäroide zu bilden, doch die biologischen Prozesse, die dieser Zellclusterbildung zugrunde liegen, sind recht komplex und umfassen mehrere zelluläre Mechanismen. Tatsächlich erfordert dies eine Zell-Zell-Adhäsion benachbarter Zellen über transmembranäre Rezeptoren an der Zelloberfläche, sogenannte Integrine, was zur Aggregation der Zellen führt. Dies führt zur Anreicherung eines weiteren Proteins namens Cadherin, das an der Zell-Zell-Adhäsion beteiligt ist. Anschließend bilden diese zusammengefügten Zellen Tight Junctions, die die anfängliche Zelladhäsion verstärken und zudem die Verdichtung des Sphäroids erhöhen. Darüber hinaus finden während des Prozesses der Sphäroidbildung komplexe Prozesse der Umgestaltung des Zytoskeletts, der Produktion der extrazellulären Matrix (ECM) sowie weiterer intrazellulärer Signalwege statt.
Nach der anfänglichen Bildung können die Sphäroide weiter wachsen – insbesondere Tumorsphäroide – und über Wochen hinweg in Kultur gehalten werden. Sie können Behandlungen und anderen Versuchsbedingungen ausgesetzt werden, auf die sie mit einer Veränderung ihrer Zellarchitektur, der Sekretion von Molekülen oder anderen zellulären Verhaltensweisen reagieren. Im Laufe der Zeit entsteht ein Gradient aus Nährstoffen und Sauerstoff zwischen den inneren und den äußeren Zellschichten. Normale zelluläre Prozesse können dabei gewisse Veränderungen erfahren. So kann beispielsweise die Zellproliferationsrate in den Kernzellen, die weniger Nährstoffen und Sauerstoff ausgesetzt sind, beeinträchtigt werden, was zu Apoptose (programmierter Zelltod) oder Nekrose (unkontrollierter Zelltod) führen kann.
Mit welchen Techniken lassen sich zelluläre Sphäroide bilden?
Verschiedene Zelltypen weisen unterschiedliche Neigungen zur Bildung von Sphäroiden auf, weshalb mehrere Methoden zur Förderung der Zellaggregation entwickelt wurden. Hier ist eine (nicht vollständige) Liste dieser Techniken:
- Bestimmte Zelltypen können sich durch die Expression von Zelladhäsionsmolekülen auf natürliche Weise zusammenlagern. So bilden Krebszellen beispielsweise häufig von selbst Sphäroide, aus denen schließlich Tumore entstehen.
- Zwar neigen manche Zellen relativ stark dazu, Aggregate zu bilden, doch können sie auch von einer gewissen Unterstützung durch die Umgebung profitieren. Diese Unterstützung kann durch die Zugabe biochemischer Komponenten erfolgen, die die Zell-Zell-Adhäsion fördern, wie beispielsweise Integrine, Cadherine oder Bestandteile der extrazellulären Matrix sowie viele andere Moleküle.
- Es ist auch möglich, Beschichtungen mit geringer Anhaftung oder nicht haftende Beschichtungen auf den Oberflächen des für die Zellaggregation verwendeten Geräts zu verwenden. Darüber hinaus könnte eine physikalische Begrenzung der Umgebung die Sphäroidbildung durch eine spezifische Form der Vertiefungen (wie beispielsweise konische Vertiefungen mit speziellen Vorsprüngen, die einen nahezu vollständigen Medienaustausch ermöglichen, wie bei denAKURA-Mikroplatten vonInSphero zu sehen) oder durch Mikrostrukturierungen mit spezifischen Mustern auf der Oberfläche zur Steuerung der Zellaggregation fördern.
- Das Aufrechterhalten der Zellen in Suspension durch Rühren kann verhindern, dass sich die Zellen an der Oberfläche anlagern, und fördert die Zell-Zell-Kontakte. Dies lässt sich zwar recht einfach umsetzen, führt jedoch häufig zu einer hohen Variabilität der Sphäroidgröße.
- Elektrische und magnetische Felder, Ultraschall oder Schallwellen können ebenfalls genutzt werden, um die Zellaggregation zu fördern.
- Mikrofluidik kann auch zur Bildung von Zellaggregaten genutzt werden, was mehrere Vorteile mit sich bringt: geringerer Reagenzienverbrauch, eine gut kontrollierte Umgebung, verbesserte Größenhomogenität zwischen Sphäroiden derselben und verschiedener Chargen sowie eine bessere Modellierung und Zellviabilität durch die Strömungsdynamik.
- Eine weitere sehr verbreitete Methode ist die„Hanging-Drop“-Methode. Dabei wird die Schwerkraft genutzt, um Zell-Zell-Interaktionen in einem schwebenden Tropfen des Mediums zu ermöglichen. Dies lässt sich zwar auf dem Deckel einer Petrischale durchführen, doch wurden einige Geräte speziell entwickelt, um die Reproduzierbarkeit und die Produktion dieser schwebenden Tropfen im Hochdurchsatzverfahren zu verbessern.
Zusammenfassung der Techniken
| Technik | Beschreibung |
|---|---|
| Natürliche Aggregation | Expression von Zelladhäsionsmolekülen. |
| Biochemische Bestandteile | Die Zell-Zell-Adhäsion fördern. |
| Beschichtungen mit geringer Haftung oder nicht haftende Beschichtungen | Die Sphäroidbildung fördern. |
| Einschränkende Rahmenbedingungen | Steuerung der Zellaggregation durch spezifische Vertiefungsformen oder Mikrostrukturierung. |
| Suspension und Rühren | Verhindern Sie die Anhaftung an der Oberfläche und fördern Sie Zell-Zell-Kontakte. |
| Physikalische Felder | Fördern Sie die Zellaggregation durch den Einsatz von elektrischen und magnetischen Feldern, Ultraschall oder Schallwellen. |
| Mikrofluidik | Bildung von Zellaggregaten in kontrollierten Umgebungen. |
| Hängender Tropfen | Nutzung der Schwerkraft zur Förderung von Zell-Zell-Interaktionen in einem schwebenden Tropfen des Mediums. |
Welche weiteren Faktoren können die Zellaggregation beeinflussen?
- Die Zelldichtespielt eine wichtige Rolle, und es ist wichtig, die optimale Zellzahl für ein bestimmtes Volumen zu ermitteln, die effektive Zell-Zell-Interaktionen fördert und so eine erfolgreiche Sphäroidbildung gewährleistet. Sind nicht genügend Zellen vorhanden, kann es zu unzureichenden Zell-Zell-Kontakten kommen, was eine schlechte Aggregation zur Folge hat. Zu viele Zellen hingegen können zu einem schlechten Zugang zu Nährstoffen, Zellstress und schließlich zum Zelltod führen. Eine konstante Zelldichte trägt zudem dazu bei, homogene und einheitliche Sphäroide für reproduzierbare Experimente zu erhalten.
- Zellkulturund Umgebungsbedingungen:Alle Faktoren, die für die Lebensfähigkeit und das Wachstum der Zellen wichtig sind, wirken sich auch auf die Sphäroidbildung aus. Tatsächlich ist es wichtig, über ausreichende Nährstoff- und Sauerstoffkonzentrationen, optimale Temperatur, pH-Wert und CO₂-Konzentrationen sowie eine für den gewählten Zelltyp geeignete Mediumzusammensetzung zu verfügen. Sind die Bedingungen nicht optimal, kann dies die zellulären Interaktionen und die Kommunikation beeinträchtigen und Zellstress bis hin zum Zelltod auslösen. Auch die von den Zellen innerhalb des Sphäroids produzierten Metaboliten beeinflussen andere Zellen. Insbesondere die von den Zellen im Zentrum des Sphäroids produzierten Metaboliten erreichen möglicherweise die Zellen der äußeren Schichten nicht, sodass die Zellen je nach ihrer Position im Sphäroid nicht denselben Metaboliten oder derselben Konzentration dieser Metaboliten ausgesetzt sind. Dies hat Auswirkungen auf die interzelluläre Kommunikation und kann auch bei den verschiedenen Schritten der Sphäroidbildung eine Rolle spielen. Auch mechanische Kräfte und Bedingungen tragen zur Sphäroidbildung bei, unabhängig davon, ob sie natürlich entstehen oder durch die gewählte Aggregationsmethode vorgegeben sind.
- Adhäsionsmoleküle und Bestandteile der extrazellulären Matrixspielen eine wichtige Rolle bei der Zelladhäsion und der Zellaggregation. Die Förderung der Expression dieser Moleküle kann ebenfalls als Einstellparameter dienen.
Welche Arten von Zellspheroiden gibt es?
Es gibt viele verschiedene Arten von Sphäroiden, von denen jede einen einzigartigen Beitrag zur Forschung leistet:
Multizelluläre Tumorsphäroide (MCTS)
Multizelluläre Tumorsphäroide (MCTS) spielen eine zentrale Rolle bei der Modellierung solider Tumoren. Diese Sphäroide, die eine Zwischenstufe zwischen 2D-Kulturen und In-vivo-Tumoren darstellen, bilden entscheidende Merkmale von Tumoren nach, wie beispielsweise die Bildung von Nährstoffgradienten und die Entstehung eines hypoxischen Kerns mit eingeschränktem Sauerstoffzugang, aber auch die physiologische interzelluläre Kommunikation und die zelluläre Heterogenität. Da sie die Tumormikroumgebung sehr genau nachbilden, sind MCTS unverzichtbar für die Erforschung der Krebsbiologie und die Erprobung von Krebstherapien.
Quelle: Kamatar, A.; Gunay, G.; Acar, H. Natürliche und synthetische Biomaterialien für die Herstellung multizellulärer Tumorsphäroide. Polymers 2020, 12, 2506.
Stammzell-Sphäroide
Sie werden aus induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) gewonnen und verfügen über die bemerkenswerte Fähigkeit, sich in verschiedene Zelltypen zu differenzieren. Diese Vielseitigkeit macht sie zu einem Eckpfeiler der Forschung im Bereich der regenerativen Medizin und des Tissue Engineering. Diese Sphäroide liefern Erkenntnisse über das Verhalten von Stammzellen und mögliche therapeutische Anwendungen.
Embryoidkörper (EBs)
Embryoidkörper (EBs), die zur vorgenannten Kategorie gehören, werden aus embryonalen Stammzellen (ESCs) und iPS-Zellen gebildet. Sie werden zur Erforschung der frühen Embryonalentwicklung genutzt. Außerdem können sie als Modell für das Tissue Engineering, die regenerative Medizin und die Zelllinienspezifizierung dienen.
Phasenbild von Embryoidkörpern (EBs) in Suspensionskultur 24 Stunden nach ihrer Bildung. Die EBs wurden aus etwa 1000 embryonalen Stammzellen der Maus (D3-Zelllinie) gebildet. Maßstab = 100 µm.
Quelle: Embryoidkörper. (22. Juni 2024). In Wikipedia.
Gewebespezifische Sphäroide
Dabei handelt es sich häufig um Sphäroide aus Mischkulturen, die verschiedene Zelltypen enthalten, um die Komplexität von Geweben nachzubilden, da diese in der Regel nicht aus einem einzigen Zelltyp bestehen. Diese Sphäroide erleichtern die Erforschung von Zell-Zell-Interaktionen, das Tissue Engineering und die Modellierung von Krankheiten. Durch die Einbeziehung verschiedener Zelltypen, die innerhalb eines Gewebes miteinander interagieren, bieten sie ein physiologisch relevanteres Modell.
Leber-Sphäroide
Diese Sphäroide bestehen aus Leberzellen (Hepatozyten, nicht-parenchymale Zellen, Lebersternzellen) und werden zur Modellierung von Leberfunktionen und -erkrankungen, zur Untersuchung des Arzneimittelstoffwechsels sowie zur Durchführung von Toxizitätstests verwendet. Sie können leberspezifische Aktivitäten nachbilden und sind daher ein wertvolles Instrument für die Leberforschung.
Neurosphären
Neurosphären, die aus neuralen Stammzellen oder Vorläuferzellen gewonnen werden, werden zur Erforschung der Neurogenese, der neuralen Differenzierung, neurodegenerativer Erkrankungen und des neuralen Tissue Engineering eingesetzt. Sie bieten ein dynamisches Modell zur Erforschung der Komplexität des Nervensystems.
Kardiosphären
Kardiosphären bestehen aus kardialen Vorläuferzellen und spielen eine entscheidende Rolle in der Forschung zur Herzregeneration, bei Modellen für Herzerkrankungen sowie bei Tests zur Kardiotoxizität. Sie bilden das mikrovaskuläre Milieu des Herzens nach und liefern Einblicke in die Reparatur von Herzgewebe und in Krankheitsmechanismen.
Adiposphären
Adiposphären werden aus Fettgewebezellen gebildet und dienen der Erforschung der Adipogenese, von Adipositas, Stoffwechselerkrankungen sowie der Arzneimitteltestung. Sie bilden das Verhalten und die Funktion des Fettgewebes nach, einschließlich der Fettspeicherung und der Hormonausschüttung.
In Anlehnung an die oben beschriebenen Beispiele lassen sich Sphäroide für alle Organe des Körpers vorstellen, vorausgesetzt, es können optimale Versuchsbedingungen ermittelt werden und es werden Vergleichsstudien mit bestehenden Modellen sowie In-vivo-Untersuchungen durchgeführt, um die Relevanz des Modells zu validieren.
Immun-Sphäroide
Diese Aggregate enthalten Immunzellen wie Lymphozyten und Makrophagen und dienen der Erforschung von Immunreaktionen, Immuntherapien und Wechselwirkungen zwischen Tumoren und dem Immunsystem. Sie sind von entscheidender Bedeutung für das Verständnis, wie Immunzellen mit anderen Zelltypen interagieren und wie diese Wechselwirkungen den Krankheitsverlauf und die Behandlungsergebnisse beeinflussen.
Vaskularisierte Sphäroide
Sie beschreiben Sphäroide aus den oben genannten Kategorien, die vaskuläre Komponenten enthalten oder aus Endothelzellen gewonnen wurden. Sie können in der Forschung zur Angiogenese, zur Gefäßbiologie und bei Arzneimitteltests im Zusammenhang mit der Blutgefäßbildung eingesetzt werden. Diese Sphäroide tragen zum Verständnis der Entstehung und Funktion von Blutgefäßen bei, was für das Tissue Engineering und die Krebsforschung von entscheidender Bedeutung ist. Die Vaskularisierung ist für die Nährstoffversorgung und das Überleben der Zellen unerlässlich und daher auch entscheidend für die Entwicklung relevanter und physiologischer Sphäroidmodelle verschiedener Gewebetypen.
Tumorsphäroide und Gefäßnetzwerk in einer mikrofluidischen Vorrichtung.
Quelle: Nashimoto Y, Okada R, Hanada S, Arima Y, Nishiyama K, Miura T, Yokokawa R. Vaskularisierter Krebs auf einem Chip: Der Einfluss der Perfusion auf das Wachstum und die Wirkstoffabgabe von Tumorsphäroiden.
Biomaterials. Jan. 2020;229:119547. doi: 10.1016/j.biomaterials.2019.119547. Online-Veröffentlichung: 17. Okt. 2019. PMID: 31710953.
Wie lassen sich Sphäroide in der medizinischen Forschung einsetzen?
Die Entwicklung von Sphäroidkulturen hat der medizinischen Forschung eine völlig neue Dimension eröffnet. Diese Zellaggregate stellen zuverlässige und kostengünstige Modelle dar, um Einblicke in Krankheitsmechanismen, biologische Signalwege sowie die Wirksamkeit und Toxizität von Therapien zu gewinnen. Sie stellen ein neues In-vitro-Modell und eine Alternative zu Tierversuchen für eine bessere Vorhersagbarkeit und eine verbesserte Übertragbarkeit auf klinische Studien am Menschen.
| Anwendung | Rolle |
|---|---|
| Drogentest | Wird zur Untersuchung sowohl der Toxizität als auch der Wirksamkeit neu entwickelter Moleküle und bereits zugelassener Arzneimittel eingesetzt und unterstützt dabei die Umwidmung von Arzneimitteln. |
| Modellierung von Krankheiten | Ein besseres Verständnis der Krankheitsmechanismen ermöglichen und biologische Signalwege aufklären. |
| Personalisierte Medizin | Kann dazu dienen, die für den einzelnen Patienten effizienteste Behandlung zu ermitteln. |
| Krebsforschung | Es bietet ein im Vergleich zu 2D-Zellkulturen überlegenes In-vitro-Modell für Tumore und unterstützt damit die Erforschung der Tumorinvasion und Metastasierung sowie die Entwicklung von Krebstherapien. |
| Gewebezüchtung | Sie dienen als Bausteine zur Entwicklung größerer 3D-Strukturen, wenn mehrere Sphäroide miteinander verschmolzen werden. Außerdem können sie zur Reparatur oder zum Ersatz von geschädigtem Gewebe eingesetzt werden. |
| Zelltherapie | Wird eingesetzt, um Zellen bei der Entwicklung von Zelltherapien auf physiologische Weise zu verabreichen. |
Es gibt viele weitere Möglichkeiten, Sphäroide in Forschung und Therapie einzusetzen, und diese werden in Zukunft wahrscheinlich noch entdeckt werden – insbesondere lassen sich die derzeitigen Nachteile von Sphäroiden eingrenzen.
Was sind die Einschränkungen bei der Verwendung von Zellspheroiden?
Trotz ihrer zentralen Rolle in der modernen biomedizinischen Forschung weist die Sphäroidkultur nach wie vor einige Einschränkungen auf:
📏 Größenbeschränkungen und Reproduzierbarkeit
Je größer ein Sphäroid ist, desto stärker ist es Nährstoffgradienten ausgesetzt und somit einer potenziellen Zellnekrose in seinem Kern. Darüber hinaus ist es wichtig, ein Herstellungsverfahren zu entwickeln, das eine gute Homogenität der Sphäroide gewährleistet, um Ergebnisse verschiedener Sphäroide vergleichen zu können. Ebenso wichtig ist es, standardisierte Methoden zu entwickeln, um reproduzierbare Daten zu erhalten.
🤖Automatisierung und Skalierbarkeit
Zwar gibt es in diesem Bereich zahlreiche Innovationen, doch ist es wichtig, automatisierte Systeme für die Herstellung und Untersuchung von Sphäroiden zu entwickeln, damit diese in großem Maßstab für die medizinische Forschung genutzt werden können.
🧑🔬 Technisches Fachwissen
Anfangs kann die Umstellung von 2D auf 2D einige Anpassungen der Laborausstattung und technische Schulungen erfordern.
🔎Begrenzte Analyse
Aufgrund ihrer 3D-Struktur können bestimmte Endpunkte, wie beispielsweise die Bildgebung, eine Herausforderung darstellen. Der Zugang zum Kern des Sphäroids könnte sich als schwierig erweisen, wodurch die Analyse möglicherweise auf die äußeren Schichten beschränkt bleibt.
🧩 Begrenzte Komplexität
Obwohl Sphäroide komplexer sind als 2D-Monolayer, weisen sie hinsichtlich ihrer Architektur, Vaskularisierung, der Anzahl der Zelltypen und ihrer Funktionen dennoch eine geringere Komplexität auf als natives Gewebe.
Fazit
Zellspheroide weisen vielversprechende Eigenschaften auf, die eine physiologischere, aussagekräftigere und effizientere Forschung ermöglichen. Durch ihren Einsatz in vielen Bereichen sind sie ein vielseitiges und wertvolles Werkzeug für Forscher und medizinisches Fachpersonal. Die stetigen Innovationen auf dem Gebiet der Spheroide in den letzten Jahren liefern zudem vielversprechende Einblicke in mögliche zukünftige Verbesserungen.
Quellen:
Białkowska K, Komorowski P, Bryszewska M, Miłowska K. Sphäroide als eine Form dreidimensionaler Zellkulturen – Beispiele für Herstellungsverfahren und die wichtigsten Anwendungsbereiche. Int J Mol Sci. 28. August 2020;21(17):6225. doi: 10.3390/ijms21176225. PMID: 32872135; PMCID: PMC7503223.
Decarli MC, Amaral R, Santos DPD, Tofani LB, Katayama E, Rezende RA, Silva JVLD, Swiech K, Suazo CAT, Mota C, Moroni L, Moraes ÂM. Zellspheroide als vielseitige Forschungsplattform: Entstehungsmechanismen, Hochdurchsatzproduktion, Charakterisierung und Anwendungen. Biofabrication. 8. April 2021;13(3). doi: 10.1088/1758-5090/abe6f2. PMID: 33592595.
Lazzari G., Couvreur P. & Mura S. (2017). Multizelluläre Tumorsphäroide: ein relevantes 3D-Modell für die präklinische In-vitro-Untersuchung von Polymer-Nanomedikamenten. Polym. Chem. 8, 4947.
