Sphäroide sind in der Biologie dreidimensionale Zellaggregate, die die Architektur und Funktion von Geweben nachahmen. In Umgebungen, die eine Anheftung an Oberflächen verhindern, können sich Zellen tatsächlich zu kugelähnlichen Strukturen, den sogenannten Sphäroiden, selbst anordnen. Das Interesse an diesen Strukturen ist in den letzten Jahren stark gestiegen, da sie ein 3D-Modell darstellen, das dem in vivo Mikromilieu von Zellen in einem lebendigen Organismus näher kommt als die klassische 2D-Zellkultur. Die 3D-Zellkultur bietet zahlreiche Vorteile für die medizinische Forschung, wie etwa die Erstellung aussagekräftigerer Modelle zur Unterstützung der Entwicklung neuer Therapien. In diesem Blogbeitrag beleuchten wir die Grundlagen der Bildung zellulärer Sphäroide und tauchen in deren vielfältige Anwendungen ein.
Sphäroidbildung – Wie aggregieren Zellen?
Es gibt verschiedene Methoden zur Bildung von Sphäroiden, jedoch sind die biologischen Prozesse hinter dieser Zellklumpung recht komplex und beinhalten diverse zelluläre Mechanismen. Sie erfordern tatsächlich die Zell-Zell-Adhäsion benachbarter Zellen über Transmembranrezeptoren an der Zelloberfläche, sogenannte Integrine, was zur Aggregation der Zellen führt. Dies treibt die Akkumulation eines weiteren Proteins namens Cadherin voran, das ebenfalls an der Zell-Zell-Adhäsion beteiligt ist. Anschließend bilden diese assemblierten Zellen Tight Junctions (dichte Verbindungen), welche die anfängliche Zelladhäsion verstärken und zudem die Kompaktierung des Sphäroids erhöhen. Darüber hinaus laufen während der Sphäroidbildung komplexe Prozesse des Zytoskelettumbaus, der Produktion extracellularer Matrix (EZM) sowie weitere intrazelluläre Signalprozesse ab.
Nach der anfänglichen Bildung können die Sphäroide weiter wachsen – insbesondere Tumorsphäroide – und über Wochen in Kultur gehalten werden. Sie können Behandlungen und anderen experimentellen Bedingungen ausgesetzt werden, auf die sie mit Modifikationen der Zellarchitektur, der Sekretion von Molekülen oder anderem zellulären Verhalten reagieren. Im Laufe der Zeit entsteht ein Gradient von Nährstoffen und Sauerstoff zwischen den inneren und den äußeren Zellschichten. Reguläre zelluläre Prozesse können dabei gewissen Modifikationen unterliegen. Beispielsweise kann die Zellproliferationsrate in den Kernzellen beeinträchtigt sein, die weniger Nährstoffen und Sauerstoff ausgesetzt sind, was zu Apoptose (programmiertem Zelltod) oder Nekrose (unkontrolliertem Zelltod) führt.
Welches sind die Techniken zur Bildung zellulärer Sphäroide?
Verschiedene Zelltypen weisen eine unterschiedliche Neigung zur Bildung von Sphäroiden auf, weshalb diverse Methoden zur Förderung der Zellaggregation entwickelt wurden. Hier ist eine (nicht vollständige) Liste dieser Techniken:
- Einige Zelltypen können durch die Expression von Zelladhäsionsmolekülen natürlich aggregieren. Krebszellen beispielsweise neigen häufig dazu, sich spontan zu Sphäroiden zusammenzulagern und schließlich Tumore zu bilden.
- Während einige Zellen von Natur aus relativ leicht Aggregate bilden, können sie zusätzlich durch ihre Umgebung unterstützt werden. Diese Unterstützung kann durch die Zugabe biochemischer Komponenten erfolgen, die die Zell-Zell-Adhäsion fördern, wie etwa Integrine, Cadherine oder Komponenten der extrazellulären Matrix sowie zahlreiche andere Moleküle.
- Es ist zudem möglich, adhäsionsarme oder nicht-adhäsive Beschichtungen auf den Oberflächen der für die Zellaggregation verwendeten Vorrichtungen zu nutzen. Darüber hinaus kann eine physische Einengung der Umgebung die Sphäroidbildung durch eine spezifische Form der Wells begünstigen (wie etwa konische Wells mit speziellen Vorsprüngen, die einen nahezu vollständigen Mediumwechsel ermöglichen, wie man es bei den InSphero AKURA Mikrotiterplatten sieht) oder durch Mikropatterning mit spezifischen Mustern auf der Oberfläche, die die Zellaggregation lenken.
- Das Halten von Zellen in Suspension durch Agitation kann verhindern, dass sich Zellen an der Oberfläche anheften, und Zell-Zell-Kontakte fördern. Obwohl dies recht einfach umzusetzen ist, führt es häufig zu einer hohen Variabilität der Sphäroidgröße.
- Elektrische und magnetische Felder, Ultraschall oder akustische Wellen können ebenfalls eingesetzt werden, um die Zellklumpung zu begünstigen.
- Mikrofluidik kann ebenfalls zur Bildung von Zellaggregaten eingesetzt werden und bietet dabei mehrere Vorteile: geringerer Reagenzienverbrauch, eine gut kontrollierte Umgebung, eine verbesserte Größeneinheitlichkeit zwischen Sphäroiden gleicher und verschiedener Chargen sowie eine bessere Modellierung und Zellviabilität durch Fluiddynamik.
- Eine weitere sehr gängige Option ist die Verwendung der Hängetropfen-Methode (Hanging-Drop-Methode). Sie macht sich die Schwerkraft zunutze, um Zell-Zell-Interaktionen in einem suspendierten Mediumstropfen zu erleichtern. Dies kann zwar auf dem Deckel einer Petrischale durchgeführt werden, jedoch wurden spezielle Vorrichtungen entwickelt, um die Reproduzierbarkeit und die Hochdurchsatzproduktion dieser hängenden Tropfen zu verbessern.
Zusammenfassung der Techniken
| Technik | Beschreibung |
|---|---|
| Natürliche Aggregation | Expression von Zelladhäsionsmolekülen. |
| Biochemische Komponenten | Förderung der Zell-Zell-Adhäsion. |
| Adhäsionsarme oder nicht-adhäsive Beschichtungen | Verbesserung der Sphäroidbildung. |
| Einschränkende Umgebung | Steuerung der Zellaggregation durch spezifische Wells-Geometrien oder Mikropatterning. |
| Suspension und Agitation | Verhinderung der Oberflächenhaftung und Förderung von Zell-Zell-Kontakten. |
| Physikalische Felder | Begünstigung der Zellclusterbildung durch den Einsatz von elektrischen und magnetischen Feldern, Ultraschall oder akustischen Wellen. |
| Mikrofluidik | Formung von Zellaggregaten in kontrollierten Umgebungen. |
| Hängender Tropfen | Nutzen der Schwerkraft zur Erleichterung von Zell-Zell-Interaktionen in einem suspendierten Mediumstropfen. |
Welche weiteren Faktoren können die Zellaggregation beeinflussen?
- Die Zelldichte hat einen direkten Einfluss, und es ist wichtig, die optimale Zellzahl für ein gegebenes Volumen zu ermitteln, um effektive Zell-Zell-Interaktionen für eine erfolgreiche Sphäroidbildung zu fördern. Sind nicht genügend Zellen vorhanden, kann dies zu unzureichenden Zell-Zell-Kontakten und damit zu einer mangelhaften Aggregation führen. Zu viele Zellen können hingegen einen schlechten Nährstoffzugang, Zellstress und schließlich den Zelltod zur Folge haben. Eine konstante Zelldichte trägt zudem zu homogenen und einheitlichen Sphäroiden für reproduzierbare Experimente bei.
- Zellkultur und Umgebungsbedingungen: Alle für die Zellviabilität und das Zellwachstum wichtigen Faktoren beeinflussen auch die Sphäroidbildung. So ist es unerlässlich, ausreichende Nährstoff- und Sauerstoffwerte, eine optimale Temperatur, einen optimalen pH-Wert und CO2-Gehalt sowie eine für den gewählten Zelltyp geeignete Zusammensetzung des Mediums sicherzustellen. Sind die Bedingungen nicht optimal, kann dies zelluläre Interaktionen und Kommunikationen beeinträchtigen und von Zellstress bis hin zum Zelltod führen. Auch die von Zellen innerhalb des Sphäroids produzierten Metaboliten beeinflussen andere Zellen. Insbesondere Metaboliten von Zellen im Zentrum des Sphäroids erreichen möglicherweise die äußeren Zellschichten nicht, wodurch die Zellen je nach ihrer Position im Sphäroid unterschiedlichen Metaboliten oder Konzentrationen ausgesetzt sind. Dies wirkt sich auf die interzelluläre Kommunikation aus und kann auch in den verschiedenen Phasen der Sphäroidbildung eine Rolle spielen. Mechanische Kräfte und Bedingungen – ob natürlich oder durch die gewählte Aggregationsmethode vorgegeben – tragen ebenfalls zur Sphäroidbildung bei.
- Adhäsionsmoleküle und Komponenten der extrazellulären Matrix spielen eine wichtige Rolle bei der Zelladhäsion und der zellulären Aggregation. Die Förderung der Expression dieser Moleküle kann ebenfalls als Stellschraube dienen.
Welche Arten von zellulären Sphäroiden gibt es?
Es existieren zahlreiche Arten von Sphäroiden, die jeweils einen einzigartigen Beitrag zur Forschung leisten:
Multizelluläre Tumorsphäroide (MCTS)
Multizelluläre Tumorsphäroide (MCTS) sind von zentraler Bedeutung für die Modellierung solider Tumore. Als Zwischenstufe zwischen 2D-Kulturen und In-vivo-Tumoren replizieren diese Sphäroide entscheidende Merkmale von Tumoren, wie etwa die Ausbildung von Nährstoffgradienten und eines hypoxischen Kerns mit reduziertem Sauerstoffzugang, aber auch die physiologische interzelluläre Kommunikation und zelluläre Heterogenität. Durch die präzise Nachbildung der Tumormikroumgebung sind MCTS unverzichtbar für die Erforschung der Krebsbiologie und die Testung von Krebsmedikamenten.
Quelle: Kamatar, A.; Gunay, G.; Acar, H. Natural and Synthetic Biomaterials for Engineering Multicellular Tumor Spheroids. Polymers 2020, 12, 2506.
Stammzell-Sphäroide
Abgeleitet von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs), verfügen sie über die bemerkenswerte Fähigkeit, sich in verschiedene Zelltypen zu differenzieren. Diese Vielseitigkeit macht sie zu einem Grundpfeiler in der regenerativen Medizin und der Gewebezüchtungsforschung. Diese Sphäroide liefern wertvolle Einblicke in das Stammzellverhalten und potenzielle therapeutische Anwendungen.
Embryonale Glühbirnen (EBs)
Als Teil der vorherigen Kategorie werden Embryoid Bodies (EBs) aus embryonalen Stammzellen (ESCs) und iPSCs gebildet. Sie werden zur Untersuchung der frühen Embryonalentwicklung eingesetzt und können zudem als Modell für Tissue Engineering, regenerative Medizin und die Bestimmung von Zelllinien (Lineage Specification) dienen.
Phasenkontrastbild von Embryoid Bodies (EBs) in Suspensionskultur nach 24 Stunden Kultivierung. Die EBs wurden aus ca. 1000 mausembryonalen Stammzellen (D3-Zelllinie) generiert. Skalenbalken = 100 µm.
Quelle: Embryoid body. (22. Juni 2024). In Wikipedia.
Gewebespezifische Sphäroide
Hierbei handelt es sich häufig um Co-Kultur-Sphäroide, die mehrere Zelltypen aufweisen, um die Komplexität von Geweben nachzubilden, da diese in der Regel nicht aus einem einzigen Zelltyp bestehen. Diese Sphäroide erleichtern die Untersuchung von Zell-Zell-Interaktionen, das Tissue Engineering und die Krankheitsmodellierung. Durch die Integration verschiedener Zelltypen, die innerhalb eines Gewebes interagieren, bieten sie ein physiologisch relevanteres Modell.
Lebersphäroide
Diese aus Leberzellen (Hepatozyten, nicht-parenchymalen Zellen, hepatischen Stellzellen) zusammengesetzten Sphäroide werden zur Modellierung von Leberfunktionen und -krankheiten, zur Untersuchung des Arzneistoffmetabolismus und zur Durchführung von Toxizitätstests eingesetzt. Sie können leberspezifische Aktivitäten reproduzieren, was sie zu einem wertvollen Werkzeug für hepatologische Studien macht.
Neurosphären
Abgeleitet von neuralen Stammzellen oder Progenitorzellen, werden Neurosphären zur Untersuchung der Neurogenese, der neuralen Differenzierung, neurodegenerativer Erkrankungen und des neuralen Tissue Engineerings eingesetzt. Sie bieten ein dynamisches Modell zur Erforschung der Komplexität des Nervensystems.
Kardiosphären
Zusammengesetzt aus kardialen Progenitorzellen, sind Kardiosphären maßgeblich an der Forschung zur Herzregeneration, an Herzerkrankungsmodellen und an Kardiotoxizitätstests beteiligt. Sie imitieren das kardiale Mikromilieu und liefern Einblicke in die Reparatur von Herzzewebe und Krankheitsmechanismen.
Adiposphären
Aus Fettgewebezellen gebildet, werden Adiposphären zur Untersuchung der Adipogenese, von Adipositas, metabolischen Erkrankungen und Drogentests eingesetzt. Sie modellieren das Verhalten und die Funktion von Fettgewebe, einschließlich Fettspeicherung und Hormonsekretion.
Ausgehend von den oben beschriebenen Beispielen ist es möglich, sich Sphäroide für alle Organe des Körpers vorzustellen, vorausgesetzt, es lassen sich optimale experimentelle Bedingungen ermitteln und es werden Vergleichsstudien mit bestehenden Modellen und in vivo durchgeführt, um die Relevanz des Modells zu validieren.
Immun-Sphäroide
Diese Aggregate enthalten Immunzellen wie Lymphozyten und Makrophagen, um Immunreaktionen, Immuntherapie und Tumor-Immun-Interaktionen zu untersuchen. Sie sind essenziell, um zu verstehen, wie Immunzellen mit anderen Zelltypen interagieren und wie diese Wechselwirkungen das Fortschreiten von Krankheiten und den Behandlungserfolg beeinflussen.
Vaskularisierte Sphäroide
Hierbei handelt es sich um Sphäroide aus den vorgenannten Kategorien, die vaskuläre Komponenten enthalten oder aus Endothelzellen hervorgegangen sind. Sie können in der Forschung zur Angiogenese, zur Gefäßbiologie und bei Arzneimittelprüfungen im Zusammenhang mit der Blutgefäßbildung eingesetzt werden. Diese Sphäroide helfen dabei, die Bildung und Funktion von Blutgefäßen zu verstehen, was für das Tissue Engineering und die Krebsforschung von entscheidender Bedeutung ist. Die Vaskularisierung ist für die Nährstoffversorgung und das Überleben der Zellen unerlässlich und daher auch kritisch für die Entwicklung relevanter und physiologischer Sphäroidmodelle verschiedener Gewebetypen.
Tumorsphäroid und vaskuläres Netzwerk in einem mikrofluidischen Chip.
Quelle: Nashimoto Y, Okada R, Hanada S, Arima Y, Nishiyama K, Miura T, Yokokawa R. Vascularized cancer on a chip: The effect of perfusion on growth and drug delivery of tumor spheroid.
Biomaterials. 2020 Jan;229:119547.doi: 10.1016/j.biomaterials.2019.119547. Epub 2019 Oct 17. PMID: 31710953.
Wie können Sphäroide in der medizinischen Forschung angewendet werden?
Die Entwicklung von Sphäroidkulturen hat der medizinischen Forschung eine völlig neue Dimension verliehen. Diese Zellaggregate stellen zuverlässige und kosteneffiziente Modelle dar, um Einblicke in Krankheitsmechanismen, biologische Signalwege sowie die Wirksamkeit und Toxizität von Behandlungen zu gewinnen. Sie repräsentieren ein neues in-vitro-Modell und eine Alternative zu Tierversuchen für eine bessere Vorhersagbarkeit und eine verbesserte Übertragbarkeit auf klinische Studien am Menschen.
| Anwendung | Rolle |
|---|---|
| Wirkstoff-Screening | Wird zur Untersuchung sowohl der Toxizität als auch der Wirksamkeit neu entwickelter Moleküle und bereits zugelassener Medikamente verwendet, was die Erschließung neuer Anwendungsgebiete für bestehende Wirkstoffe (Drug Repurposing) unterstützt. |
| Krankheitsmodellierung | Ermöglichen ein besseres Verständnis von Krankheitsmechanismen und die Aufklärung biologischer Signalwege. |
| Personalisierte Medizin | Möglicherweise anwendbar, um die wirksamste Behandlung für einzelne Patienten zu ermitteln. |
| Krebsforschung | Sie bieten im Vergleich zu 2D-Zellkulturen ein überlegenes In-vitro-Modell für Tumore und unterstützen so die Erforschung von Tumorinvasion, Metastasierung sowie die Entwicklung von Krebsmedikamenten. |
| Gewebezüchtung | Dienen als Bausteine zur Entwicklung größerer 3D-Strukturen durch die Fusion mehrerer Sphäroide. Sie können zudem für die Reparatur oder den Ersatz geschädigten Gewebes eingesetzt werden. |
| Zelltherapie | Werden eingesetzt, um Zellen im Rahmen von Zelltherapieentwicklungen physiologisch zu applizieren. |
Zukünftig werden und können vermutlich noch viele weitere Einsatzmöglichkeiten für Sphäroide in Forschung und Therapie entdeckt werden, insbesondere wenn die aktuellen Nachteile von Sphäroiden minimiert werden können.
Welche Einschränkungen gibt es bei der Verwendung von zellulären Sphäroiden?
Trotz ihrer zentralen Rolle in der modernen biomedizinischen Forschung weist die Sphäroidkultur nach wie vor einige Einschränkungen auf:
📏 Größenbeschränkungen und Reproduzierbarkeit
Je größer ein Sphäroid ist, desto stärker ist es Nährstoffgradienten und damit einer potenziellen Zellnekrose im Kern ausgesetzt. Darüber hinaus ist es wichtig, eine Produktionsmethode mit einer guten Sphäroid-Homogenität zu entwickeln, um die Ergebnisse verschiedener Sphäroide vergleichen zu können. Um reproduzierbare Daten zu erhalten, ist es zudem entscheidend, standardisierte Methoden anzustreben.
🤖 Automatisierung und Skalierbarkeit
Obwohl es in diesem Bereich zahlreiche Innovationen gibt, müssen automatisierte Systeme für die Produktion und Untersuchung von Sphäroiden entwickelt werden, um sie für die medizinische Forschung in großem Maßstab nutzbar zu machen.
🧑🔬 Technische Expertise
Der Umstieg von 2D auf 3D erfordert zu Beginn möglicherweise Anpassungen der Laborausrüstung sowie technische Schulungen.
🔎 Eingeschränkte Analyse
Aufgrund ihrer 3D-Struktur können sich bestimmte Untersuchungsmethoden wie die Bildgebung als anspruchsvoll erweisen. Der Zugang zum Kern des Sphäroids kann erschwert sein, wodurch die Analyse möglicherweise auf die äußeren Schichten beschränkt bleibt.
🧩 Eingeschränkte Komplexität
Obwohl sie komplexer sind als 2D-Monolayer, weisen Sphäroide hinsichtlich Architektur, Vaskularisierung, Anzahl der Zelltypen und Funktionen im Vergleich zu nativem Gewebe nach wie vor eine geringere Komplexität auf.
Fazit
Zelluläre Sphäroide weisen äußerst vielversprechende Eigenschaften für eine physiologischere, aussagekräftigere und effizientere Forschung auf. Ihr Einsatz in zahlreichen Bereichen macht sie zu einem vielseitigen und wertvollen Werkzeug für Forschende und Mediziner. Die kontinuierlichen Innovationen im Bereich der Sphäroide in den letzten Jahren lassen zudem vielversprechende Einblicke in kommende potenzielle Verbesserungen zu.
Quellen:
Białkowska K, Komorowski P, Bryszewska M, Miłowska K. Spheroids as a Type of Three-Dimensional Cell Cultures-Examples of Methods of Preparation and the Most Important Application. Int J Mol Sci. 2020 Aug 28;21(17):6225. doi: 10.3390/ijms21176225. PMID: 32872135; PMCID: PMC7503223.
Decarli MC, Amaral R, Santos DPD, Tofani LB, Katayama E, Rezende RA, Silva JVLD, Swiech K, Suazo CAT, Mota C, Moroni L, Moraes ÂM. Cell spheroids as a versatile research platform: formation mechanisms, high throughput production, characterization and applications. Biofabrication. 2021 Apr 8;13(3). doi: 10.1088/1758-5090/abe6f2. PMID: 33592595.
Lazzari G., Couvreur P. & Mura S. (2017). Multicellular tumor spheroids: a relevant 3D model for the in vitro preclinical investigation of polymer nanomedicines. Polym. Chem. 8, 4947.
