Der Einsatz der Mikrofluidik in Biologie und Medizin eröffnet dank einer präziseren Kontrolle der Mikroumgebung der Zellen spannende neue Möglichkeiten für die In-vitro-Zellkultur.
Zwei wichtige und miteinander verknüpfte Themen in diesem Bereich sind organ on chip und die 3D-Zellkultur. Die leistungsstarken Werkzeuge, die durch die Mikrofabrikation einer Vielzahl von Polymer- und Nicht-Polymer-Materialien in der Mikrofluidik und im Mikropatterning entwickelt wurden, ermöglichen eine große Vielfalt im Bereich des Tissue Engineerings der Mikroumgebung. Dies macht die Entwicklung von In-vitro-Modellen mit beispiellosen Eigenschaften in jedem Labor mit kosteneffizienten und zeiteffizienten Methoden möglich. Die Mikroumgebung lässt sich nicht nur effizient kontrollieren, sondern das geringe Volumen dieser Modelle ermöglicht auch eine effiziente Parallelisierung von In-vitro-Studien, was die Kosten senkt und ein Screening von Wirkstoffen mit höherem Durchsatz ermöglicht [1] [2].
Für Forscher, die in diesen Bereichen tätig sind oder tätig werden möchten, steht eine breite Palette an Materialien mit unterschiedlichsten Eigenschaften hinsichtlich Biokompatibilität, optischen und mechanischen Eigenschaften, Handhabbarkeit und Kosten zur Verfügung. Ziel dieses Übersichtsartikels ist es, Materialien vorzustellen, die in der Mikrofluidik verwendet werden und sich auch für die Zellkultur eignen. Wir werden deren Stärken und Schwächen im Vergleich zueinander kurz vorstellen.
Ein großes Problem beim Übergang von der konventionellen In-vitro-Zellkultur zur mikrofluidischen Zellkultur ist der Maßstab. Aufgrund von Maßstabsänderungen, wie etwa dem Verhältnis von Volumen zu Oberfläche in solchen Kulturvorrichtungen, können sich die Eigenschaften der kultivierten Zellen erheblich verändern. Beispielsweise unterscheidet sich das Verhältnis von Zellkulturoberfläche zum Medienvolumen drastisch von dem konventioneller Kulturen. [3]
Duroplaste
PDMS (Polydimethylsiloxan) ist dank seines einfachen Mikrofabrikationsprozesses, seiner optischen Transparenz, seiner elastomeren Eigenschaften und der Fähigkeit, dauerhaft mit Glas oder sich selbst verbunden zu werden, das Material der Wahl für die Mikrofluidik. Diese Eigenschaften machen PDMS zu einem extrem weit verbreiteten Material für die Mikrofabrikation mikrofluidischer Geräte im Labormaßstab.
In der Zellkultur prädestinieren die Biokompatibilität und Gaspermeabilität von PDMS das Material für den Einsatz in Mikrokanälen. Seine optischen Eigenschaften in Verbindung mit einer geringen Autofluoreszenz machen es ideal für die Fluoreszenzdetektion. Zudem lässt es sich ohne Reinraum formen und verbinden, was es für Forschungsteams attraktiv macht, die in die Mikrofluidik einsteigen möchten.
PDMS weist jedoch auch einige Nachteile auf, insbesondere im Hinblick auf die Absorption kleiner Moleküle. Dies kann insbesondere in der Zellkultur für Drogentests kritisch sein, da PDMS die Konzentrationen der Zielsubstanzen erheblich verändern kann, was bei der Überwachung von Nano- und Mikromolaren Konzentrationen von entscheidender Bedeutung sein kann.[4]
PDMS ist zudem wasserdampfdurchlässig, weshalb das System austrocknen kann oder eine instabile osmotische Konzentration in den Kanälen aufweisen kann.
Diese Eigenschaften können die Verwendung von PDMS für Longer-Experimente recht komplex machen. Dennoch ist das Material seit Langem ein fester Bestandteil der Mikrofluidik, und die umfangreiche Literatur zu diesem Thema
Thermoplastische Polymere für die Zellkultur
Thermoplastische Polymere wie Polycarbonat und Polystyren bilden eine weitere Materialklasse in der Mikrofluidik, die ebenfalls Anwendung in der Zellkultur findet. Der Mikrofabrikationsprozess verläuft zügig; der Weg vom Basismaterial zu einem funktionalen Chip ist in wenigen Minuten machbar und eignet sich für jeden Maßstab – von der Prototypenfertigung bis zur Industrialisierung.
Sie weisen in der Regel steife Grenzflächen auf, was den Bonding-Prozess im Vergleich zu PDMS erschwert. Dennoch macht die große Vielfalt an Thermoplasten sie vielversprechend für die Entwicklung zukünftiger Anwendungen, da sich stets ein Material mit passenden Eigenschaften finden lässt und alle denselben, lediglich leicht modifizierten Herstellungsprozess erfordern.
Zu den in der Mikrofluidik und für Zellkulturen verwendeten Thermoplasten gehören:
Polystyren (PS) und Cyclo-Olefin-Polymer (COP)[5] haben sich als geeignet für Zellkulturen erwiesen und reduzieren gleichzeitig die Absorption kleiner hydrophober Moleküle sowie die Freisetzung unvernetzter Oligomere, wie sie bei PDMS auftreten.
Cyclo-Olefin-Copolymere (COC)[6] [7] [8] sind eine Kategorie von COPs, die aus mehreren Monomertypen bestehen. Einige Varianten zeichnen sich durch eine hohe biologische Inertheit aus und eignen sich nach einer Luft-Plasmabehandlung für HeLa-Zellkulturen. [9]
Polymethylmethacrylat (PMMA) ist ein Thermoplast, der sich nicht nur im Heißprägeverfahren verarbeiten, sondern auch per Laser strukturieren lässt, wodurch die Anzahl der für den Mikrofabrikationsprozess benötigten Komponenten sinkt. [10] [11] [12]
Polycarbonat (PC) ist bereits ein weit verbreitetes Material für Zellkulturen und wird auch in der Mikrofluidik eingesetzt. Aufgrund der geschlossenen Kanalgeometrie in Kombination mit der Undurchlässigkeit des Materials erweist es sich jedoch unter den spezifischen Bedingungen der Mikrofluidik als suboptimal. PC wird daher häufig in Verbindung mit PDMS in hybriden Chips verwendet, um dank der geringen Sauerstoffdurchlässigkeit Sauerstoffgradienten zu erzeugen. [13]
Thermoplaste wie COC, PMMA und PC weisen nachweislich eine deutlich stärkere Autofluoreszenz auf als PDMS, weshalb sie sich für bestimmte Detektionsmethoden nicht eignen. [14]
Weiche thermoplastische Elastomere
Der Einsatz elastomerer Weichmaterialien ist für die Mikrofluidik insgesamt von großer Bedeutung. Die geringe Steifigkeit solcher Materialien macht sie ausreichend verformbar, um integrierte mechanische Elemente wie Mikropumpen und Ventile direkt herzustellen. Dies erleichtert die Implementierung komplexer Funktionen in elastomeren Werkstoffen wie PDMS erheblich. Eine weitere Klasse elastomerer Materialien sind weiche thermoplastische Elastomere (sTPE). Hierbei handelt es sich um Blockcopolymere, die aus einer elastomeren Matrix mit harten thermoplastischen Domänen bestehen; letztere sind so klein, dass sie im Maßstab der Mikrostrukturen (µm) kontinuierlich erscheinen. Dies verleiht ihnen chemische Eigenschaften und ein einfaches Formgebungsverfahren, das harten Thermoplasten ähnelt, während die elastomere Beschaffenheit ein problemloses Bonding sowie mikromechanische Funktionen ermöglicht.
Flexdym[15] ist ein sTPE, das entwickelt wurde, um die Nachteile von PDMS in der Mikrofluidik hinsichtlich Rapid Prototyping, Adsorption, Absorption und Substrat-Bonding zu überwinden, während die Vorteile wie Weichheit, optische Eigenschaften, Biokompatibilität und Gaspermeabilität erhalten bleiben. Es eignet sich dank seiner Gasdurchlässigkeit (obwohl diese geringer ist als bei PDMS) für Zellkulturen, und das Prototyping kann extrem schnell erfolgen: Vom Formprozess bis zum final vergeistigten Chip vergehen nur wenige Minuten. Zudem ist es spritzgussfähig, was die Skalierung auf industrielle Maßstäbe unkompliziert macht.
Perfluorpolyether (PFPE) [16] wurden für Zellkulturen eingesetzt und zeigen eine Performance, die der von PDMS-Chips ähnelt, was hauptsächlich auf ihre Gasdurchlässigkeit zurückzuführen ist. PFPE sind weich und transparent, wodurch sie PDMS sehr ähnlich sind. Sie können direkt durch Photolithographie strukturiert werden, was einen erheblichen Vorteil darstellt, da dies den Verzicht auf eine Gussform ermöglicht und die Anzahl der Fertigungsschritte für Mikrochips reduziert. Zu den Nachteilen zählen jedoch die hohen Kosten sowie die ausgeprägte chemische Inerte des Materials, die Oberflächenmodifikationen erschwert.
Glas [17] besitzt einige sehr interessante Eigenschaften für die mikrofluidische Zellkultur; insbesondere seine chemische Stabilität und seine optischen Qualitäten lassen sich für eine höhere Messwiederholbarkeit nutzen. Komplexe und kostenintensive Herstellungsprozesse machen es jedoch zu einem Nischenmaterial für Forschung und Industrie gleichermaßen. Glas bleibt ein Premiummaterial für die Prototypenfertigung, wobei die Vielseitigkeit der verfügbaren Oberflächenbehandlungen und seine Beständigkeit die höheren Kosten vor allem bei wiederverwendbaren Chips aufwiegen können.
Papierbasierte Mikrofluidik ist eine neuere Entwicklung zur Realisierung kostengünstiger Point-of-Care-Anwendungen. Das Aufbringen von Kultur-Mikroreaktoren auf Papier durch Oberflächenmodifikation zur Verbesserung der Zelladhäsion ist besonders vielversprechend für künftige kostengünstige Zelldetektions-Diagnostika. [18]
[1] Su, X., Young, E. W., Underkofler, H. A., Kamp, T. J., January, C. T., & Beebe, D. J. (2011). Microfluidic cell culture and its application in high-throughput drug screening: cardiotoxicity assay for hERG channels. Journal of biomolecular screening, 16(1), 101-111.
[2] An, D., Kim, K., & Kim, J. (2014). Microfluidic system based high throughput drug screening system for curcumin/TRAIL combinational chemotherapy in human prostate cancer PC3 cells. Biomolecules & therapeutics, 22(4), 355-362.
[3] Walker, G. M., Zeringue, H. C., & Beebe, D. J. (2004). Microenvironment design considerations for cellular scale studies. Lab on a Chip, 4(2), 91-97.
[4] Toepke, M. W., & Beebe, D. J. (2006). PDMS absorption of small molecules and consequences in microfluidic applications. Lab on a Chip, 6(12), 1484-1486.
[5] Su, X., Young, E. W., Underkofler, H. A., Kamp, T. J., January, C. T., & Beebe, D. J. (2011). Microfluidic cell culture and its application in high-throughput drug screening: cardiotoxicity assay for hERG channels. Journal of biomolecular screening, 16(1), 101-111.
[6] Mottet, G., Perez-Toralla, K., Tulukcuoglu, E., Bidard, F. C., Pierga, J. Y., Draskovic, I., … & Louis Viovy, J. (2014). A three dimensional thermoplastic microfluidic chip for robust cell capture and high resolution imaging. Biomicrofluidics, 8(2), 024109.
[7] Jena, R. K., & Yue, C. Y. (2012). Cyclic olefin copolymer based microfluidic devices for biochip applications: Ultraviolet surface grafting using 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine. Biomicrofluidics, 6(1), 012822.
[8] Nunes, P. S., Ohlsson, P. D., Ordeig, O., & Kutter, J. P. (2010). Cyclic olefin polymers: emerging materials for lab-on-a-chip applications. Microfluidics and nanofluidics, 9(2-3), 145-161.
[9] Johansson, B. L., Larsson, A., Ocklind, A., & Öhrlund, Å. (2002). Characterization of air plasma‐treated polymer surfaces by ESCA and contact angle measurements for optimization of surface stability and cell growth. Journal of applied polymer science, 86(10), 2618-2625.
[10] Hong, T. F., Ju, W. J., Wu, M. C., Tai, C. H., Tsai, C. H., & Fu, L. M. (2010). Rapid prototyping of PMMA microfluidic chips utilizing a CO2 laser. Microfluidics and nanofluidics, 9(6), 1125-1133.
[11] Wei, C. W., Cheng, J. Y., & Young, T. H. (2006). Elucidating in vitro cell-cell interaction using a microfluidic coculture system. Biomedical microdevices, 8(1), 65-71.
[12] Ma, L., Zhou, C., Lin, B., & Li, W. (2010). A porous 3D cell culture micro device for cell migration study. Biomedical microdevices, 12(4), 753-760.
[13] Chang, C. W., Cheng, Y. J., Tu, M., Chen, Y. H., Peng, C. C., Liao, W. H., & Tung, Y. C. (2014). A polydimethylsiloxane–polycarbonate hybrid microfluidic device capable of generating perpendicular chemical and oxygen gradients for cell culture studies. Lab on a Chip, 14(19), 3762-3772.
[14] Piruska, A., Nikcevic, I., Lee, S. H., Ahn, C., Heineman, W. R., Limbach, P. A., & Seliskar, C. J. (2005). The autofluorescence of plastic materials and chips measured under laser irradiation. Lab on a Chip, 5(12), 1348-1354.
[15] Roy, E., Stewart, G., Mounier, M., Malic, L., Peytavi, R., Clime, L., … & Veres, T. (2015). From cellular lysis to microarray detection, an integrated thermoplastic elastomer (TPE) point of care Lab on a Disc. Lab on a Chip, 15(2), 406-416.
[16] Jellali, R., Paullier, P., Fleury, M. J., & Leclerc, E. (2016). Liver and kidney cells cultures in a new perfluoropolyether biochip. Sensors and Actuators B: Chemical, 229, 396-407.
[17] Jang, K., Sato, K., Igawa, K., Chung, U. I., & Kitamori, T. (2008). Development of an osteoblast-based 3D continuous-perfusion microfluidic system for drug screening. Analytical and bioanalytical chemistry, 390(3), 825-832.
[18] Corradini, E., Curti, P. S., Meniqueti, A. B., Martins, A. F., Rubira, A. F., & Muniz, E. C. (2014). Recent advances in food-packing, pharmaceutical and biomedical applications of zein and zein-based materials. International journal of molecular sciences, 15(12), 22438-22470.
