Per Definition besteht ein Liposom aus einer Lipiddoppelschicht, die eine wässrige Phase umschließt. Liposomen werden zunehmend eingesetzt, um Wirkstoffe gezielt und größenkontrolliert zu verabreichen. Hier kommt die Mikrofluidik ins Spiel. Tatsächlich wird die Wissenschaft der Fluidiksysteme für die extrem präzise Steuerung sehr kleiner Volumina genutzt, was sich hervorragend für die Erzeugung mikro- und nanosikalischer Liposomen eignet. In dieser Application Note vergleichen wir Literaturdaten mit Ergebnissen, die mit zwei mikrofluidischen Chip-Designs zur Generierung von Nanoliposomen erzielt wurden: dem Herringbone-Mikromischer und der hydrodynamischen Fokussierung. Diese mikrofluidischen Chips wurden mit einer hydrophilen Beschichtung versehen. Zur Erzeugung der Nanoliposomen entschieden wir uns für PLGA (Poly(Milchsäure-co-Glycolsäure)), gelöst in Acetonitril. Die wässrige Phase besteht aus Wasser und Tensid (1 % PVA).
Herringbone-Mischer
Der Herringbone-Mikromischer-Chip ist eine All-in-One-Lösung, die das Mischen zweier Fluide in einem mikrofluidischen Kanal auf einfache und effiziente Weise ermöglicht. Dieses Werkzeug eignet sich für zahlreiche Anwendungen wie Immunoassays oder PCR-Produktmischungen, aber auch für die Generierung von Nanoliposomen. Dieser Chip-Typ kann aus verschiedenen Materialien hergestellt werden, darunter PDMS, Glas und Thermoplaste (PC, COC, COP usw.).
Mit dieser Methode ist es laut Roces et al. 2020, Pharmaceutics, möglich, Nanoliposomen mit einer Größe zwischen 100 und 200 nm zu erzeugen.
In der Praxis haben wir Nanoliposomen mithilfe eines Herringbone-Mikromischer-Chips aus Polycarbonat (microfluidic ChipShop, 10000019) hergestellt. Die Ergebnisse zeigen, dass wir Nanoliposomen mit einer durchschnittlichen Größe von 247 nm ± 78,8 nm generiert haben. Die Messungen wurden mittels dynamischer Lichtstreuung unter Verwendung des Zetasizer Nano ZS an 11 Proben mit Flussratenverhältnissen von 1 bis 15 durchgeführt.
Abbildung 2: Messung der Durchmesser der Nanoliposomen, die mit einem Staggered-Herringbone-Mischer-Gerät (microfluidic ChipShop, 10000019) erzeugt wurden. „FRR“ steht für Flow Rate Ratio (Flussratenverhältnis): Es entspricht dem Verhältnis zwischen dem Fluss der kontinuierlichen Phase und dem Fluss der dispersen Phase. Messungen durchgeführt von Christelle Angély an einem Zetasizer Nano ZS (Malvern Panalytical) der Plattform für Biochemie und Biophysik des Instituts für Psychiatrie und Neurowissenschaften in Paris.
Hydrodynamische Flussfokussierung
Die mikrofluidische Vorrichtung zur hydrodynamischen Flussfokussierung ermöglicht das präzise Mischen von Reagenzien mit kurzen Mischzeiten unter laminaren Strömungsbedingungen, was beispielsweise die Erzeugung monodisperser Nanopartikel einstellbarer Größe ermöglicht.
Unter Anwendung dieser Flussfokussierungstechnik ist es möglich, Nanoliposomen mit einer Größe von >150 nm und typischerweise um 200 nm zu erzeugen. Je nach Zusammensetzung der Nanoliposomen kann sich deren Größe jedoch erheblich verändern, wie die Arbeiten von Karnik et al. aus dem Jahr 2008 zeigen. Tatsächlich ist das Team in der Lage, Nanopartikel mit einem Durchmesser von 31 nm (± 1 nm) in hochgradig monodisperser Form herzustellen.
In unserem Fall konnten wir Nanoliposomen mit einer durchschnittlichen Größe von 250,9 nm ± 66,8 nm unter Verwendung eines Flussfokussierungs-Chips aus Polycarbonat (microfluidic ChipShop, 10000004) erzeugen. Die Messungen wurden mittels dynamischer Lichtstreuung unter Verwendung des Zetasizer Nano ZS an 11 Proben mit Flussratenverhältnissen von 1 bis 15 durchgeführt.
Abbildung 4: Messung der Durchmesser der Nanoliposomen, die mit einer Flussfokussierungsvorrichtung (microfluidic ChipShop, 10000004) erzeugt wurden. „FRR“ steht für Flow Rate Ratio (Flussratenverhältnis): Es entspricht dem Verhältnis zwischen dem Fluss der kontinuierlichen Phase und dem Fluss der dispersen Phase. Messungen durchgeführt von Christelle Angély an einem Zetasizer Nano ZS (Malvern Panalytical) der Plattform für Biochemie und Biophysik des Instituts für Psychiatrie und Neurowissenschaften in Paris.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die hier vorgestellten beiden Methoden Nanoliposomen ähnlicher Größe, d. h. mit einem Durchmesser von ca. 250 nm, unabhängig vom Flussratenverhältnis generieren konnten. Die Wahl der Zusammensetzung des Nanoliposoms – sei es die Auswahl des Lipids, des Lösungsmittels oder der wässrigen Phase – sollte daher berücksichtigt werden. Darüber hinaus sind mehrere gut dokumentierte Techniken wirksam, um die Größe der erzeugten Nanoliposomen zu reduzieren. So ist es beispielsweise möglich, eine Beschallung (Sonifikation) der Probe (1 bis 5 min) durchzuführen, um deren Größe um bis zu 50 % zu verringern. Zahlreiche Publikationen beschreiben Filtration und/or Dialyse als äußerst effiziente Methoden zur Aufreinigung von Nanoliposomen und zur damit verbundenen Reduzierung ihrer Größe (von 50 auf 80 nm).
