Per Definition besteht ein Liposom aus einer Lipid-Doppelschicht, die eine wässrige Phase einkapselt. Liposomen werden zunehmend eingesetzt, um Wirkstoffe zielgerichtet und größenkontrolliert zu verabreichen. Hier kommt die Mikrofluidik ins Spiel. Tatsächlich wird die Wissenschaft der Fluidhandhabungssysteme zur äußerst präzisen Steuerung sehr kleiner Volumina genutzt, was sich hervorragend für die Erzeugung von Liposomen im Mikro- und Nanobereich eignet. In diesem Anwendungshinweis vergleichen wir Literaturangaben mit Ergebnissen, die mit zwei verschiedenen Designs von Mikrofluidik-Chips zur Erzeugung von Nanoliposomen erzielt wurden: dem Herringbone-Mikromischer und der hydrodynamischen Strömungsfokussierung. Diese Mikrofluidik-Chips wurden mit einer hydrophilen Beschichtung versehen. Zur Herstellung von Nanoliposomen haben wir uns für PLGA (Poly(Milchsäure-Co-Glykolsäure)) entschieden, das in Acetonitril gelöst wurde. Die wässrige Phase besteht aus Wasser und einem Tensid (1 % PVA).
Fischgräten-Mischer
Der Mikromischer-Chip im Fischgrätenmuster ist eine All-in-One-Lösung, die das einfache und effiziente Mischen zweier Flüssigkeiten in einem mikrofluidischen Kanal ermöglicht. Dieses Werkzeug eignet sich für zahlreiche Anwendungen wie Immunoassays oder das Mischen von PCR-Produkten, aber auch für die Herstellung von Nanoliposomen. Dieser Chiptyp kann aus verschiedenen Materialien hergestellt werden, darunter PDMS, Glas und Thermoplaste (PC, COC, COP usw.).
Mit diesem Verfahren lassen sich laut Roces et al. 2020, „Pharmaceutics“, Nanoliposomen mit einer Größe zwischen 100 und 200 nm herstellen.
In der Praxis haben wir Nanoliposomen mithilfe eines aus Polycarbonat gefertigten Herringbone-Mikromischer-Chips (microfluidic ChipShop, 10000019) hergestellt. Die Ergebnisse zeigen, dass wir Nanoliposomen mit einer durchschnittlichen Größe von 247 nm ± 78,8 nm erzeugt haben. Die Messungen erfolgten mittels dynamischer Lichtstreuung mit dem Zetasizer Nano ZS an 11 Proben mit Durchflussverhältnissen im Bereich von 1 bis 15.
Abbildung 2: Messung der Durchmesser von Nanoliposomen, die mit einem versetzten Fischgrätenmischer erzeugt wurden (microfluidic ChipShop, 10000019). „FRR“ steht für „Flow Rate Ratio“ (Durchflussverhältnis): Es entspricht dem Verhältnis zwischen dem Durchfluss der kontinuierlichen Phase und dem Durchfluss der dispergierten Phase. Die Messungen wurden von Christelle Angély mit einem Zetasizer Nano ZS (Malvern Panalytical) auf der Plattform für Biochemie und Biophysik des Instituts für Psychiatrie und Neurowissenschaften in Paris durchgeführt.
Hydrodynamische Strömungsfokussierung
Die mikrofluidische Vorrichtung zur hydrodynamischen Strömungsfokussierung ermöglicht eine präzise Vermischung der Reagenzien mit kurzen Mischzeiten unter laminaren Strömungsbedingungen, wodurch beispielsweise monodisperse Nanopartikel mit einstellbarer Größe erzeugt werden können.
Mithilfe dieser Flow-Fokussierungstechnik lassen sich Nanoliposomen mit einer Größe von >150 nm und in der Regel etwa 200 nm erzeugen. Je nach Zusammensetzung der Nanoliposomen kann sich ihre Größe jedoch erheblich ändern, wie in der 2008 vorgestellten Arbeit von Karnik et al. gezeigt wurde. Tatsächlich ist es dem Team gelungen, Nanopartikel mit einem Durchmesser von 31 nm (± 1 nm) in hochgradig monodisperser Form herzustellen.
In unserem Fall konnten wir mithilfe eines aus Polycarbonat gefertigten Flow-Fokussier-Chips (microfluidic ChipShop, 10000004) Nanoliposomen mit einer durchschnittlichen Größe von 250,9 nm ± 66,8 nm erzeugen. Die Messungen erfolgten mittels dynamischer Lichtstreuung mit dem Zetasizer Nano ZS an 11 Proben bei Durchflussverhältnissen im Bereich von 1 bis 15.
Abbildung 4: Messung der Durchmesser von Nanoliposomen, die mit einer Durchflussfokussierungsvorrichtung erzeugt wurden (microfluidic ChipShop, 10000004). „FRR“ steht für „Flow Rate Ratio“ (Durchflussratenverhältnis): Es entspricht dem Verhältnis zwischen dem Durchfluss der kontinuierlichen Phase und dem Durchfluss der dispergierten Phase. Die Messungen wurden von Christelle Angély mit einem Zetasizer Nano ZS (Malvern Panalytical) auf der Plattform für Biochemie und Biophysik des Instituts für Psychiatrie und Neurowissenschaften in Paris durchgeführt.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass mit den beiden hier vorgestellten Methoden Nanoliposomen ähnlicher Größe, d. h. mit einem Durchmesser von etwa 250 nm, unabhängig vom Durchflussratenverhältnis erzeugt werden konnten. Die Wahl der Zusammensetzung der Nanoliposomen – sei es die Wahl des Lipids, des Lösungsmittels oder der wässrigen Phase – sollte daher berücksichtigt werden. Darüber hinaus gibt es mehrere gut dokumentierte Techniken, mit denen sich die Größe der erzeugten Nanoliposomen wirksam verringern lässt. So ist es beispielsweise möglich, die Probe einer Ultraschallbehandlung (1 bis 5 min) zu unterziehen, um ihre Größe um bis zu 50 % zu verringern. Zahlreiche Veröffentlichungen beschreiben Filtration und/oder Dialyse als sehr effiziente Verfahren zur Reinigung von Nanoliposomen und damit zur Verringerung ihrer Größe (von 50 auf 80 nm).
