In deze handleiding behandelen we gedetailleerd alle stappen voor de vervaardiging van een microfluïdisch systeem, aan de hand van het voorbeeld van een dubbele emulsie- en trapping-chip. Dit protocol, geïnspireerd op en overgenomen uit de artikelen geschreven door Ho, Lee en Liu gepubliceerd in 2016 in Scientific Reports en door Kole et al. gepubliceerd in 2015 in J. Res. Natl. Inst. Stand. Technologie, biedt u alle handvatten, van ontwerp tot microfabricage, om uw eigen systeem te bouwen.
Het ontwerpen van een systeem
Het onderstaande ontwerp is ontwikkeld voor het genereren van dubbele emulsiedruppels.
Hieronder vindt u een gedetailleerd protocol (overgenomen uit Kole et al. gepubliceerd in 2015 in J. Res. Natl. Inst) waarmee u een microfluïdisch systeem kunt ontwerpen:
1. Allereerst is het noodzakelijk om computer-aided design (CAD)-software te gebruiken om het microfluïdische systeem te ontwerpen.
2. Vervolgens adviseren wij u om de omtrek van een wafer met een diameter van 100 mm te gebruiken (dit hangt uiteraard af van de afmetingen van uw systeem) en een standaard flat als buitenste grens van het array-systeem, en de kenmerken van het systeem te patroneer binnen een centrum van ongeveer 90 mm van de wafer om mogelijke randdefecten te voorkomen.
3. Voor het vervaardigen van een chip met meerdere lithografieniveaus, waarbij photoresist moet worden aangebracht op de gestructureerde elementen en uitlijning tussen opeenvolgende lithografieniveaus vereist is, raden wij de volgende aanwijzingen aan:
3.1. U kunt de chipkenmerken, zoals de onderste uitlijnmarkeringen van het substraat, op het eerste ontwerpniveau plaatsen. Deze volgorde is optimaal voor het structureren van elementen met verticale nanometerafmetingen in een platte photoresistfilm, die conformeus is aangebracht op een ongestructureerd substraat.
Als de verticale afmetingen van de gestructureerde elementen in de latere fotolithografie-niveaus kritiek zijn, en als het ontwerp van de chip en de array dit toelaat, plaats dan de elementen op lagere niveaus richting de periferie van de array. Deze plaatsing vermindert vervolgens de variatie in de dikte van de centrifugaal gecoate photoresistfilm op deze elementen van het lagere niveau op locaties dichter bij het centrum van de wafer, waar de elementen van het hogere niveau zullen worden geplaatst.
3.2 Vervolgens moeten de onderste uitlijnmarkeringen naar de periferie van de wafer worden geplaatst om de hoekuitlijning te verbeteren en de resulterende radiale variatie in filmdikte te verminderen, en op locaties die de kenmerken van de chip niet verstoren. Een ideale plaatsing van de onderste uitlijnmarkeringen maakt het gebruik van een enkele strook lineaire tape mogelijk om meerdere onderste uitlijnmarkeringen af te schermen tijdens het centrifugaal coaten van de photoresist zonder de chipkenmerken te bedekken. Dit behoudt de zichtbaarheid van de onderste uitlijnmarkeringen en zorgt tegelijkertijd voor een hogere fotolithografie. Het wordt aanbevolen om ten minste één paar onderste uitlijnmarkeringen op te nemen voor elk hoger fotolithografie-niveau.
3.3. In deze derde stap kunt u chipkenmerken zoals microfluïdische kanalen, inlaat- en uitlaatreservoirs en bovenste uitlijnmarkeringen van het fotomasker op de bovenste ontwerpniveaus plaatsen. Als de verticale afmetingen van deze elementen kritiek zijn, en als het ontwerp van de chip en de die dit toelaat, kunt u deze elementen van het bovesnte niveau dichter bij het centrum van de wafer plaatsen. Deze plaatsing profiteert van de verminderde variatie in filmdikte als gevolg van het aanbrengen van een centrifugale photoresist op de elementen van het lagere niveau die optimaal richting de periferie van de die zijn geplaatst. Zo moeten de onderste uitlijnmarkeringen op het substraat zichtbaar zijn door de bovenste uitlijnmarkeringen op het fotomasker, dat grotendeels ondoorzichtig zal zijn voor het modelleren van een malstructuur in een negatieve photoresist.
4. Tot slot kunt u tijdens het fotolithografie-proces de complementaire uitlijnmarkeringen via het fotomasker op het substraat uitlijnen.
Het structureren van een chipmal
Er zijn vele mogelijke benaderingen om een mal voor een microfluïdische chip te maken, waarbij gebruik wordt gemaakt van verschillende materialen en methoden. De meest gebruikte is een fotolithografische benadering die idealiter geschikt is voor rapid prototyping. Deze bestaat uit het centrifugaal coaten en modelleren van SU-8, een op epoxy gebaseerde negatieve photoresist, op een silicumwafer. De siliciummal voor het bovenste substraat werd gemaakt door middel van dubbellaags SU-8-structurering, waarbij de eerste gestructureerde laag de dwarsdoorsnede van de micropipetten, vangstructuren en het microfluïdische kanaal definieert, terwijl de tweede laag de vangstructuren en het hoofdfluïdische kanaal definieert. De siliciummal voor het onderste substraat werd gemaakt door middel van eenlaags SU-8-structurering, die de vangstructuren en het hoofdfluïdische kanaal definieert.
Siliciummal voor het bovenste substraat
1. De eerste stap bestaat uit het spincoaten van een nanometrische film van SU-8 2010 op een kaal siliciumwafer.
1.1. Centreer hiervoor het siliciumwafer op de klem van een centrifuge met behulp van een centreermal.
1.2 Plaats ongeveer 10 ml SU-8 2010 in het midden van de wafer en zorg ervoor dat er geen luchtbellen ontstaan.
1.3. De eerste laag van het bovenste substraat, SU-8 2010, wordt op het siliciumwafer gespincosat bij 5000 tpm, wat een dikte van 8 µm opleverde.
2. Verwarm het siliciumwafer met een nanometerfilm van SU-8 2010 gedurende 2 minuten op 95 °C op een kookplaat.
3. De eerste fotolithografische belichting van de nanometrische SU-8 2010-film moet vervolgens worden uitgevoerd.
3.1. Plaats hiertoe het siliciumwafer met de nanometrische film van SU-8 2010 en het eerste fotomasker in de contactaligner.
3.2. Plaats het siliciumwafer met de nanometerfilm van SU-8 2010 en het fotomasker in zacht contact.
3.3. Gebruik een i-line filter om de nanometrische SU-8 2010-film te belichten bij een golflengte van 365 nm met een dosis van 80 mJ.cm-2.
4. Bak het siliciumwafer met de SU-8 2010-nanometerfilm na belichting opnieuw op een kookplaat gedurende 2 minuten op 95 °C.
5. Het patroon kan nu worden ontwikkeld in de belichte nanometerfilm van SU-8 2010.
5.1. Dompel hiertoe het siliciumwafer met de belichte nanometerfilm van SU-8 2010 gedurende 1 minuut onder in de SU-8-ontwikkelaar onder voorzichtig roeren.
5.2. Spoel vervolgens het siliciumwafer met de ontwikkelde kenmerken in SU-8 2010 gedurende 10 seconden af in isopropylalcohol en droog het met stikstof.
6. Bak het siliciumwafer met de ontwikkelde structuren in SU-8 2010 gedurende 30 minuten op een kookplaat op 150 °C. Deze patronen hechten stevig aan het substraat.
7. Maskeer de gebieden van de siliciumwafer met lagere uitlijningsmarkeringen die zijn geprogrammeerd in de SU-8 2010 met behulp van bijvoorbeeld een strook afplaktape met een breedte van 6 mm (0,25 inch). Deze afplaktape zal de lagere uitlijningsmarkeringen afdekken tijdens het centrifugale coatinproces. Dek geen gebieden van de siliciumwafer af waar structuurelementen van het apparaat op een hoger niveau worden aangebracht, aangezien dit fotolithografie in deze gebieden voorkomt.
8. Het is nu mogelijk om de tweede film van SU-8 2010 spin-coat op de gemaskeerde siliciumwafer met de eerste patronen van SU-8 2010.
8.1. Centreer hiervoor de siliciumwafer met SU-8 2010-patronen op de chuck van een centrifuge met behulp van een centreermal.
8.2 Plaats ongeveer 10 ml SU-8 2010 in het midden van de wafer en zorg ervoor dat er geen luchtbellen ontstaan.
8.3 Voor de tweede laag wordt SU-8 2010 aangebracht met een spinsnelheid van 2000 rpm, wat een totale dikte oplevert van 15 µm
9. U kunt de afplaktape nu verwijderen
10. Bak de wafer met een microscopische film van SU-8 2010 gedurende 8 minuten op een hete plaat op 95 °C.
11. Nu kunt u de tweede fotolithografische belichting van de microscopische film van SU-8 2010 uitvoeren.
11.1. Plaats hiertoe de siliciumwafer met de microscopische film van SU-8 2010 in de contactaligner samen met het tweede fotomasker voor micro-schaal elementen van het apparaat.
11.2. Lijn de eerder getekende nanometermarkeringen uit met de microscopische markeringen op het fotomasker. Zorg ervoor dat u de bovenste en onderste uitlijningsmarkeringen uitlijnt.
11.3. Breng de siliciumwafer met de microscopische film van SU-8 2010 en het fotomasker in zacht contact (soft contact).
11.4. Gebruik een i-line filter om de film van SU-8 2010 te belichten bij een golflengte van 365 nm met een dosering van 160 mJ.cm-2.
12. Bak na belichting de siliciumwafer met de belichte microscopische film van SU-8 2010 gedurende 8 minuten op de hete plaat op 95 °C.
13. Het is nu tijd om het patroon te ontwikkelen in de belichte microscopische film van SU-8 2010.
13.1. Bereid hiertoe twee SU-8-ontwikkelaarhouders voor een eerste grove verwijdering van SU-8 2010, gevolgd door een reinigende spoeling.
13.2 Dompel de wafer met de belichte microscopische film van SU-8 2010 gedurende 45 s onder in de eerste houder terwijl u deze voorzichtig schudt.
13.3 Dompel de wafer met de gedeeltelijk ontwikkelde microscopische film van SU-8 2010 gedurende 30 s onder in de tweede houder terwijl u deze voorzichtig roert.
13.4. Spoel de wafer met een volledig ontwikkelde microscopische film van SU-8 2010 af met isopropylalcohol en droog deze met stikstof.
14. Inspecteer de verkregen apparaatmal met behulp van lichtmicroscopie. Als er resten SU-8 2010 achterblijven, spoel de wafer dan af.
Siliconen mal voor het bodemsubstraat
Voor het bodemsubstraat werd een enkele laag SU-8 2010 van een patroon voorzien met een dikte van 15 µm bij een spinsnelheid van 1500 rpm.
Het wordt aanbevolen om de filmdikte van de gestructureerde elementen van de SU-8 2010 te meten met bijvoorbeeld een 'scanning probe surface profilometer' of een atoomkrachtmicroscoop.
Het gieten van een apparaat
Nadat de siliconen mallen waren gefabriceerd, werden ze gegoten met PDMS (Sylgard-184). De besturingslaag werd gegoten in een mengverhouding van 7:1 (basis:uithardingsmiddel). Het stroomkanaalmembraan werd geproduceerd door PDMS met een mengverhouding van 20:1 te spincoaten op de siliconen mal van de stroomlaag. Belangrijk is dat het PDMS-membraan contact maakt met de onderkant van het stroomkanaal bij respectievelijk 30, 25 en 20 psi voor apparaten met PDMS-spincoatsnelheden van 1000, 1200 en 1600 rpm. Nadat het PDMS-besturingssubstraat was gesneden en er gaten in waren geponst, werden zowel het gesneden PDMS-besturingssubstraat als het PDMS-stroomlaagmembraan op de siliconen mal in een zuurstofplasmareactor geplaatst. Het gesneden PDMS-besturingslaagsubstraat werd vervolgens zorgvuldig uitgelijnd en gebonden met het PDMS-stroomlaagmembraan met behulp van een aangepast uitlijningsplatform op een optische microscoop. Een dun PDMS-membraan scheidt het microfluïdische kanaal en de besturingslagen, die twee verschillende functies dienen en onafhankelijk van elkaar worden gestuurd. Om de vloeistofstroom naar de vangkamers te leiden, blokkeert een pneumatisch gestuurde kleppenset boven het microfluïdische kanaal de stroom in het hoofdmicrofluïdische kanaal wanneer de kleppenset wordt geactiveerd. Een tweede regelkleppenset direct boven de vangkamers oefent compressie uit op gevangen dubbele emulsies wanneer de kleppenset wordt geactiveerd. Aangezien de twee kleppensets onafhankelijk van elkaar kunnen worden bediend, is het vangen ontkoppeld van de compressie. Ten slotte werd het PDMS-substraat op dit glazen objectglaasje gebonden.
Een glazen capillaire microfluïdische inrichting werd gefabriceerd door een taps toelopend rond capillair, een vierkant capillair en injectienaalden aan elkaar te bevestigen met 5-minuten-epoxy. Eerst werd het ronde glascapillair getrokken met behulp van een pipettrekker. Het tapse capillair werd vervolgens geschuurd met schuurpapier van korrel 1200 om een opening van 100 µm te verkrijgen voor de collectietube. Het buitenoppervlak van een schone injectietube met een opening van 15 µm, die op dezelfde manier was getrokken en geschuurd, werd behandeld met trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silaan om het oppervlak hydrofoob te maken. Vervolgens werden de injectietube en de collectietube gestoken in een vierkant capillair dat op een glazen objectglaasje was geplaatst, waarna ze werden uitgelijnd onder een optische microscoop. Injectienaalden werden afgesneden en met 5-minuten-epoxy op het glazen objectglaasje gelijmd. Tot slot werden micro-tubes aangesloten op de injectienaalden.
Vangen van dubbele emulsies
Dubbele emulsies werden gevangen in de microfluïdische chip voor de toepassing van mechanische krachten. Dubbele emulsies met een diameter tussen 40 μm en 90 μm werden eerst gegenereerd in een glazen capillaire microfluïdische chip en vervolgens opnieuw geïnjecteerd in de microfluïdische chip met een verdunning van 10x. Om dubbele emulsies in de vangkamers vast te zetten, werd regelklepset 1 vervolgens onder druk gezet op 10 – 15 psi om het hoofdmicrofluïdische kanaal te blokkeren, wat de stroomweerstand in het hoofdmicrofluïdische kanaal vergrootte. De stroomweerstandsverhouding tussen de microkanalen en het hoofdmicrofluïdische kanaal zal afnemen, waardoor meer vloeistofstroomlijnen door de microkanalen zullen gaan.
Dit vergroot de vangefficiëntie van de dubbele emulsies aanzienlijk en het is mogelijk om alle 14 vangkamers binnen een minuut gevuld te hebben. Een dubbele emulsie wordt gevangen als de straal van de dubbele emulsie kleiner is dan de instantane kritische stroombreedte, die wordt bepaald door de stroomweerstandsverhouding tussen de micropipet en het hoofdmicrofluïdische kanaal.
