Elke techniek heeft zijn voor- en nadelen, en de keuze hangt af van de microfluïdica-toepassing. Uiteindelijk kan het nauwkeurig meten van afschuifspanning wetenschappers helpen het celgedrag onder stromingsomstandigheden beter te begrijpen.
Wat is de definitie van afschuifspanning?
Afschuifspanning wordt gedefinieerd als de spanning die ontstaat wanneer een tangentiële kracht op een oppervlak inwerkt. De definitie van afschuifspanning toegepast op biologie en microfluïdica is de wrijvingskracht van een biologische vloeistofstroom die inwerkt op cellen of weefsels.Hoe bepaal je afschuifspanning?
De afschuifspanning van vloeistoffen neemt toe met de vloeissnelheid en de viscositeit; daarom kan deze voor Newtonse vloeistoffen worden berekend volgens de wet van Newton met de volgende relatie^{1}:\tau =\eta \frac{\partial v}{\partial z}
waarbij \eta viscositeit de viscositeit is (g/cm-s = Poise)\frac{\partial v}{\partial z} de snelheidsgradiënt of afschuifsnelheid is (s^{-1}), In het SI-systeem is de eenheid Pascal (Pa), maar in het cardiovasculaire systeem wordt vaak een andere eenheid gebruikt: dyn/cm2 (1Pa= 10 dyn/cm2).
De vloeistofstroom heeft niet in elk punt van het kanaal dezelfde snelheid, waardoor een snelheidsverdeling ontstaat met een snelheidsprofiel dat in de meeste eenvoudige gevallen van laminaire stroming de vorm heeft van een parabool. De vloeistofsnelheid is het hoogst in het centrum en het laagst nabij de kanaalwand. Wanneer z=0, wordt de door de vloeistof veroorzaakte afschuifspanning de 'wandschuifspanning' genoemd en wordt de snelheidsgradiënt gewoonlijk de 'wandschuifsnelheid' genoemd. De orde van grootte van de wandschuifspanning is doorgaans de hoogste waarde in het kanaal. Bij experimenten met adherente cellen of wanneer men de schadelijke effecten van afschuifspanning wil vermijden, is de wandschuifspanning doorgaans de gehanteerde waarde.
Bij het opzetten van een biologie-experiment met microfluidics is het cruciaal om rekening te houden met afschuifspanning. Het uiteindelijke doel kan enerzijds zijn om afschuifspanning te vermijden en te reduceren tot de minimale waarde om celbeschadiging en zelfs celsterfte te voorkomen, of anderzijds om de in vivo afschuifspanning na te bootsen om fysiologische processen te bestuderen, zoals de impact van mechanische spanningen op cellen.
Om een biologisch proces te reproduceren is det belangrijk om te weten wat er in vivo plaatsvindt. Talrijke artikelen hebben dit fenomeen en de in vivo consequenties beschreven.
In vivo afschuifspanning
Wherever there is flow, shear stress exists. In vivo, shear stress is mostly due to the frictional force of blood flow against the vessel walls. In our body, some cells are continuously under shear stresses such as endothelial cells and kidney epithelial cells but flow patterns are not uniform in the vascular system^{2}:
- In aders en kleine arteriën: Over het algemeen worden een laminaire stroming & een hoge wandschuifspanning waargenomen
- In takken en bochten: Verstoord stromingspatroon & Lage wandschuifspanning
De hemodynamische krachten en de resulterende mechanische spanning leiden tot talrijke biologische reacties die de afgelopen decennia grondig zijn geïdentificeerd. De eerst waarneembare impact is een verandering in morfologie doordat de cellen in de richting van de stroming worden uitgerekt. Na blootstelling aan afschuifspanning is er bovendien sprake van een duidelijke reorganisatie van het cytoskelet^{3}, de uitlijning van microtubuli en een verandering in de actinedistributie.
Zo is aangetoond dat afschuifspanning de genexpressie verandert, de activatie van signaalroutes reguleert en invloed heeft op calciumopname, celdifferentiatie, proliferatie en eiwitexpressie. Wanneer de afschuifspanning toeneemt, worden proliferatiemechanismen geactiveerd.
Daarnaast zijn vasculaire hermodelleringsprocessen te observeren met een uitzetting van de vaatdiameter en een toename van de wanddikte^{4}. Daarentegen leiden lage waarden van de afschuifspanning tot een verkleining van de vaatdiameter.
Celgedrag onder afschuifspanning is in vele artikelen beschreven. Afhankelijk van de cellijn kan de impact verschillend zijn. Bij stamcellen kan dit differentiatie induceren en bij endotheliale cellen (EC's) heeft afschuifspanning een enorme impact op het fenotype en kan het zelfs tot bepaalde pathologieën leiden.
Bijvoorbeeld in gebieden met oscillerende afschuifspanning kan dit leiden tot pathologische veranderingen in de vaatwanden en vergroot het het risico op atherosclerose^{5}. Veranderingen in afschuifspanning kunnen tevens een rol spelen bij aneurysma's als gevolg van de synthese van reactieve zuurstofsoorten (ROS), stikstofoxide (NO), groeifactoren en metalloproteïnasen.
Afschuifspanning speelt een belangrijke rol in diverse biologische processen op moleculair en klinisch niveau. Mechanische krachten worden waargenomen door de cellen, wat leidt tot mechanotransductie naar biologische reacties. Hieronder volgt een samenvatting van de verschillende effecten die in de literatuur worden beschreven, afhankelijk van het stromingspatroon en de afschuifspanning:
Gemiddelde waarden van de afschuifspanning in humane arteriën onder basale omstandigheden liggen rond de 2-20 dyne/cm². Het is belangrijk te benadrukken dat zelfs bij een afschuifspanning van slechts 4 dyne/cm² in vivo morfologische veranderingen worden waargenomen. Veel hogere waarden^{6} (van 30 tot 100 dyne/cm²) kunnen worden waargenomen nabij arteriële takken en sterke bochten zoals de aortaboog en bifurcaties, terwijl in aders doorgaans veel lagere waarden van 1 tot 6 dyne/cm² worden gemeten.
In vitro afschuifspanning
In conventionele 2D-celkweken worden cellen niet blootgesteld aan mechanische krachten zoals afschuifspanning, spanning (trekspanning) en compressie, die wel van invloed zijn op de orgaanontwikkeling en -functie.
Als er bijvoorbeeld geen vloeistofstroom is, kan de interactie tussen de bestudeerde cellen enerzijds en bloed- en immuuncellen anderzijds niet worden geëvalueerd. Dit is een aanzienlijke beperking van celkweekstudies.
Daarom is het gebruik van een microfluidics-device een levensvatbaar alternatief voor traditionele in vitro-technieken vanwege de fysiologische relevantie. Microfluidics kan een 3D biomimetische micro-omgeving bieden en wordt meer recent zelfs ingezet om organ-on-a-chip-systemen te creëren teneinde in vitro organen na te bootsen. Dergelijke toepassingen sluiten nauw aan bij wat er in vivo gebeurt, maar de nieuwe uitdaging bestaat uit het meewegen van mechanische krachten zoals afschuifspanning.
In microfluidic devices wordt afschuifspanning gecreëerd door de injectie van de vloeistofstroom. Vanwege de kleine afmetingen van microfluidics-apparatuur is de stroming lamineair; dit is bijgevolg een uitstekende manier om stromingen na te bootsen die worden aangetroffen in aders en kleine arteriën, waar de stroming doorgaans unidirectioneel en lamineair is^{7}. In grotere arteriën zijn de aangetroffen stromingen vaak pulserend en lamineair. In een microfluidics-experiment kan het debiet periodiek worden gewijzigd om dit stromingstype na te bootsen.
Over het algemeen kunnen de meeste stromingspatronen worden nagebootst met microfluidics, met als enige uitzondering turbulente stroming, die zelden binnen biologische systemen wordt aangetroffen. Experimenteren met microfluidics is zodoende een goede in vivo-benadering^{8}. Aan de andere kant kan afschuifspanning ook worden beschouwd als een nadeel vanwege de inherente schadelijke effecten die bij hoge niveaus worden waargenomen. Gelukkig is het mogelijk om een microfluidics-experiment zo te ontwerpen dat de afschuifspanning geen ongewenste effecten veroorzaakt.
In beide situaties – het onderzoeken van een biologisch fenomeen of wanneer afschuifspanning als beperkende factor wordt gezien – is het cruciaal om de tijd te nemen en rekening te houden met bepaalde parameters bij het ontwerpen van het experiment.
Microfluidics en afschuifspanning in celexperimenten
Van alle aspecten waarmee rekening moet worden gehouden bij het ontwerpen van een microfluidics-experiment, is het niveau van de afschuifspanning waaraan de cellen worden blootgesteld een fysiologisch belangrijk aandachtspunt. In microfluidics-devices zijn er verschillende parameters die de afschuifspanning beïnvloeden: de afmetingen en geometrie van de kanalen, de celconcentratie, het type cellijn, de wijze waarop het debiet wordt toegediend, enzovoort. Enkele van de genoemde parameters worden nader toegelicht om te begrijpen hoe afschuifspanning in microfluidic devices kan worden gecontroleerd en gemeten.
Het ontwerpen van een microfluidics-experiment
Het imiteren van in vivo afschuifspanning: experimentele waarden
In experimenten waar statische en biomimetische condities gewenst zijn, ligt de gebruikte waarde tussen: 0,2 en 0,5 dyne/cm². Om de stroming door een specifiek type bloedvat te imiteren, kunnen de onderstaande aangegeven waarden voor afschuifspanningen en afschuifsnelheden als referentie worden gebruikt:
Keuze van cellijnen
Celresponsen op afschuifspanning en hun vermogen om vloeistofkrachten te weerstaan zijn afhankelijk van het celtype. In sommige studies zijn verschillende celtypen onder dezelfde omstandigheden geobserveerd, wat leidde tot de conclusie dat er een breed scala aan reacties op afschuifspanning bestaat, afhankelijk van de gebruikte cel. Een stap in het ontwerpen van het experiment is om te bepalen welke cellijnen moeten worden gebruikt en welk debiet moet worden toegepast op basis van de gewenste uitkomst.
Ontwerp van chips
In elk vloeistofsysteem is het vermogen om afschuifspanning te voorspellen van groot belang om de gevolgen voor het celfenotype te voorspellen^{11}. Daarom kan bij het ontwerpen van een experiment en een nieuwe microfluidic chip, de afschuifspanning worden berekend of gemodelleerd.
Keuze van het stromingsregelsysteem
In microfluidics en celexperimenten is het cruciaal om een nauwkeurige en gelijkmatige stromingsregeling te hebben. Dit is een sleutelparameter voor het beheersen van de afschuifspanning en bijgevolg is de keuze van het instrument voor de stromingsregeling belangrijk.
Er zijn verschillende opties zoals spuitpompen, peristaltische pompen, of drukregelsystemen met of zonder flow switches. Elk van deze systemen heeft zijn voor- en nadelen en de keuze hangt af van de microfluidic toepassing. De volgende review gaat dieper in op de relatieve voor- en nadelen van populaire methoden voor stromingsregeling.
Bij het omgaan met afschuifspanning zijn er belangrijke nadelen te vermijden: een lage responstijd, ongewenste debietoscillaties en oncontroleerbare fluctuaties. Deze nadelen kunnen leiden tot een groot verschil tussen het berekende/gesimuleerde debiet en de werkelijkheid. Om een debiet te verkrijgen dat zo dicht mogelijk bij het gewenste ligt, met een snelle responstijd en nauwkeurige stromingsregeling, kan een drukregelsysteem een van de beste oplossingen op de markt zijn.
Hoe meet je afschuifspanning?
Het evalueren van de afschuifspanning in een celkweek onder stroming kan op meerdere manieren worden gedaan. De afschuifspanning kan worden geëvalueerd met behulp van theoretische en numerieke methoden uit de vloeistofdynamica. Om de stroming, en daarmee de afschuifspanning, in een microfluidic opstelling te berekenen, moet men de Navier-Stokes-vergelijking oplossen, het analytisch of numeriek om het snelheidsprofiel voor de beschouwde geometrie te vinden. Bij eenvoudige geometrieën zoals een breed rechthoekig kanaal of een buisvormig kanaal is de analytische oplossing eenvoudig en te vinden in de literatuur. Voor een rechthoekig kanaal met afmetingen w*h*l met h>w>>l kan de wandafschuifspanning bijvoorbeeld worden berekend als \tau=\frac{6\eta Q}{h²W} waarbij Q het debiet is. Voor een cilindrisch kanaal is de afschuifspanning \tau=\frac{4\eta Q}{R^{3}}/\pi.
Deze eenvoudige formules vertegenwoordigen echter niet de afschuifspanning voor complexe geometrieën, waar het over het algemeen beter is om een computersimulatie uit te voeren om de afschuifspanning of afschuifsnelheid te schatten.
Deze berekeningen zijn erg nuttig om de afschuifspanning zelfs nauwkeurig te schatten. Wanneer men echter de afschuifspanning in een microfluidic experiment zo goed mogelijk experimenteel wil bepalen, kunnen verschillende methoden worden gebruikt die een lokale meting of schatting van de afschuifspanning in het interessegebied mogelijk maken. We hebben een eenvoudige (maar handige) tool ontwikkeld om u te helpen bij het bepalen van de geschatte druk in uw chip.
Voor onderzoek aan celkweken kan het wenselijk zijn om de afschuifspanning zo dicht mogelijk bij de cellen te meten. Hiervoor zijn verschillende meetmethoden beschikbaar.
Op cel gebaseerde sensor
Stromingsafschuifspanning kan leiden tot activering van bepaalde signaaltransductieroutes^{12}. Een methode die is ontwikkeld om afschuifspanning te meten maakt gebruik van genetisch gecodeerde fluorescerende celsensoren die reageren op de activering van de afschuifspanningsroute.
Vloeibare kristallen
Het potentiële gebruik van vloeibare kristallen als meettechniek voor afschuifspanning is aangetoond in microfluidic apparaten^{13}. Deze experimentele techniek is gebaseerd op de eigenschappen van vloeibare kristallen en hun chirale moleculaire structuren. Wanneer afschuifspanning wordt uitgeoefend, buigt de structuur van de moleculen, wat kan leiden tot een verandering in polarisatie of golflengte die kan worden gemeten.
Micro-deeltjesvelocimetrie
Micro-deeltjesvelocimetriesystemen (µ-PIV) kunnen worden gebruikt om een nauwkeurige uitlezing te krijgen van de wandafschuifspanning die ook het celoppervlak direct kan oplossen^{14}. Dit maakt het mogelijk om het stromingsprofiel te meten om de afschuifspanning te bepalen. Een µ-PIV-systeem bestaat uit een hogesnelheidscamera gesynchroniseerd met een laser met dubbele caviteit die de deeltjes verlicht die in de vloeistofstroom zijn gebracht en hun positie met hoge nauwkeurigheid bewaakt. Dergelijke systemen zijn erg krachtig, maar de complexiteit van de implementatie maakt ze ongeschikt voor eenvoudige metingen van afschuifspanning.
Laser-Doppler-velocimetrie
Een andere manier om snelheidsprofielen in vloeistofstromen dicht bij het grensvlak te meten, is het gebruik van de dopplerverschuiving van laserlicht^{15}. Hierbij wordt de dopplerverschuiving van laserlicht dat in de stroom wordt gereflecteerd gemonitord om het stromingsprofiel van de vloeistof te meten en de afschuifspanning te bepalen. De apparatuur voor een dergelijke meting is eenvoudiger dan bij beeldvelocimetrie, aangezien de laser niet hoeft te worden gesynchroniseerd met een camera en het slechts nodig is om de frequentieverschuiving te meten, hoewel het proces minder gedocumenteerd is en de resultaten minder nauwkeurig zijn.
Desondanks is dit een veelbelovend alternatief voor kosteneffectieve stromingsmeting en de evaluatie van afschuifspanning dicht bij de cellen.
Bibliografie
- Transport phenomena, R. B. Bird, W. E. Stewart, and E. N. Lightfoot, John Wiley and Sons, Inc., New York(1960). 780 pages.$11.50. (1961). AIChE Journal, 7(2), pp.5J-6J.
- Chiu, J. and Chien, S. (2011). Effects of Disturbed Flow on Vascular Endothelium: Pathophysiological Basis and Clinical Perspectives. Physiological Reviews, 91(1), pp.327-387.
- Malek, A., Izumo S. (1996). Mechanism of endothelial cell shape change and cytoskeletal remodeling in response to fluid shear stress. J Cell Sci, (Pt 4):713-26.
- Glagov, S., Zarins, C. and Giddens, D. (1994). Hemodynamics, the structure of the artery wall and atherosclerosis. Atherosclerosis, 109(1-2), p.343.
- Davies, P. (2008). Hemodynamic shear stress and the endothelium in cardiovascular pathophysiology. Nature Clinical Practice Cardiovascular Medicine, 6(1), pp.16-26.
- Dewey, C., Bussolari, S., Gimbrone, M. and Davies, P. (1981). The Dynamic Response of Vascular Endothelial Cells to Fluid Shear Stress. Journal of Biomechanical Engineering, 103(3), p.177.
- Franklin, K. J. (1937). Veins and the nervous system. In “A Monograph on Veins” (K. J. Franklin, ed.), Chapter 10.
- Freund, J., Goetz, J., Hill, K. and Vermot, J. (2012). Fluid flows and forces in development: functions, features and biophysical principles. Development, 139(16), pp.3063-3063.
- Papaioannou TG(1), Stefanadis C. (2005) Vascular wall shear stress: basic principles and methods. Hellenic J Cardiol 46(1):9-15.
- Kim, L., Toh, Y., Voldman, J. and Yu, H. (2007). A practical guide to microfluidic perfusion culture of adherent mammalian cells. Lab on a Chip, 7(6), p.681.
- Barber, R. and Emerson, D. (2007). Optimal design of microfluidic networks using biologically inspired principles. Microfluidics and Nanofluidics, 4(3), pp.179-191.
- Varma, S. and Voldman, J. (2015). A cell-based sensor of fluid shear stress for microfluidics. Lab Chip, 15(6), pp.1563-1573.
- Martel, J., Bradford, A. Bruno, (2008). Shear stress measurement in Microfluidic systems: Liquid Crystal Technique. ASME, pp. 2009-2018; 10 pages
- Rossi, M., Lindken, R., Hierck, B. P., & Westerweel, J. (2009). Tapered microfluidic chip for the study of biochemical and mechanical response at subcellular level of endothelial cells to shear flow. Lab on a Chip, 9(10), 1403-1411.
- Campagnolo, L., Nikolić, M., Perchoux, J., Lim, Y. L., Bertling, K., Loubiere, K., … & Bosch, T. (2013). Flow profile measurement in microchannel using the optical feedback interferometry sensing technique. Microfluidics and Nanofluidics, 14(1-2), 113-119.
