De lever speelt een fundamentele rol bij stofwisselingsprocessen, zoals de regulering van de glucosespiegel in het bloed, de aanmaak van plasma-eiwitten, het metabolisme van geneesmiddelen en de productie van gal [1][2], en heeft zowel morfologisch als functioneel gezien een complexe structuur [3].
Gezien het belang ervan is er de afgelopen decennia uitgebreid onderzoek naar gedaan om inzicht te krijgen in de mechanismen van het metabolisme en de toxiciteit van geneesmiddelen (DILI – door geneesmiddelen veroorzaakte leverschade), evenals in leveraandoeningen zoals hepatitis, cirrose, fibrose en kanker [4][5][6].
Kort overzicht van de structuur van de sinusoïden in de lever
De leverpoortader (afkomstig uit de darmen) en de leverslagader voeren het bloed naar de lever, waar het zich vermengt in capillairen die sinusoïden worden genoemd en wordt opgevangen in de centrale leverader, waarna het terug naar het hart wordt getransporteerd.
De lever bestaat uit zich herhalende eenheden, de lobuli, met een zeshoekige vorm, die bestaan uit hepatocyten (HC’s) die in koordachtige structuren rond de sinusoïden zijn gerangschikt, gescheiden door een perisinusoïdale ruimte, de ruimte van Disse.
De hepatocyten zijn de parenchymale levercellen, die voornamelijk betrokken zijn bij de synthese van eiwitten en gal en bij het levermetabolisme, terwijl de belangrijkste niet-parenchymale (NPC) cellen de sinusoïdale endotheelcellen van de lever (LSEC’s), de Kupffer-cellen (macrofagen) en de stercellen zijn. Hepatocyten ontvangen de voedingsstoffen van de sinusoïdale cellen via uitwisselingen door de ruimte van Disse heen [2] [7][8].
In vitro-modellen van een kunstlever
Een ‘lever-op-een-chip’-model: de kunstmatige leversinusoïde
We hebben besloten om hier de door Lee et al. ontwikkelde kunstmatige leversinusoïde te beschrijven. Zij hebben een microfluïdisch platform ontworpen waarmee een fysiologische micro-omgeving (massatransportomstandigheden) kan worden nagebootst voor het zaaien van primaire hepatocyten [11].
Details over het ontwerp van de chip
Het microfluïdische platform bestond uit een kanaal voor de doorstroming van voedingsstoffen en geneesmiddelen en een celcompartiment voor het zaaien van dicht opeengepakte hepatocyten.
Er is zelfs aangetoond dat hoge dichtheden van primaire cellen de vorming van cel-celinteracties mogelijk maken, wat gepaard gaat met een verhoogde levensvatbaarheid en metabolische activiteit.
In het ontwerp van de chip is een doorlaatbare, endotheelachtige barrière met een sinusvormige vorm opgenomen, bestaande uit een reeks parallelle microkanalen, om (i) hoge schuifspanningen te voorkomen die schadelijk kunnen zijn voor de HC’s en (ii) de HC’s in het celgebied dicht bij elkaar te plaatsen.
Hoe maak je een lever op een chip?
Microfabricage van chips
SU-8 (een negatieve fotoresist) werd van een patroon voorzien door middel van fotolithografie op een siliciumwafer in twee stappen: er werd een 1 µm dikke SU-8-laag aangebracht door middel van spin-coating om de kanalen van de endotheelachtige barrière te creëren, waarna een 30 µm dikke SU-8-laag werd gebruikt om de kanalen voor de stroming en het zaaien van de cellen te maken.
Vervolgens werd polydimethylsiloxaan (PDMS) werden gerepliceerd uit de SU-8-mal en op een glasplaatje bevestigd.
Het ontwerpen van de chipparameters om de microcirculatie in de lever na te bootsen
De chip is ontworpen om een volumestroom van voedingsstoffen van 100 pL/s te garanderen (voor ongeveer 250 hepatocyten in het celgebied), wat kenmerkend is voor de microcirculatie in de lever. Daartoe zijn de breedte, hoogte en lengte van de kanalen vastgesteld op respectievelijk (50 x 30 x 1200) µm en (2 x 1 x 30) µm voor het stroomkanaal en de doorlaatbare barrière.
Door gebruik te maken van een dwarsdoorsnede van de barrièrekanalen van 2 x 1 µm werd gezorgd voor een lage convectieve stroming, en dus voor een hoge totale vloeistofweerstand (1000 keer hoger dan in het vloeistofkanaal), waardoor diffusietransport mogelijk werd. Op deze manier werden de HC’s blootgesteld aan lage schuifspanningen en konden via diffusie door de barrière voedingsstoffen opnemen.
Het ontwerpen van de chipparameters om de belasting van dicht opeengepakte hepatocyten te regelen
Dankzij het ontwerp van de endotheelachtige barrière konden er bovendien HC’s met een hoge dichtheid worden aangebracht zonder dat deze of de barrière zelf beschadigd raakten.
Er is vastgesteld dat de smalle doorsnede van de kanalen de vervorming van de celmembranen aan het grensvlak vermindert.
Zo zorgde een positieve stroming ervoor dat de cellen zonder verstopping naar de bodem van het celgebied werden geleid, wat resulteerde in een hoge celdichtheid. Bovendien zorgde een toenemende weerstand die door de cellen werd veroorzaakt voor een afname van de toevoersnelheid aan het einde van het zaaiproces.
Microfluïdische chip voor de kweek van primaire cellen: resultaten en conclusie
Zowel primaire hepatocyten van ratten als van mensen werden in het celgebied aangebracht en de levensvatbaarheid van de cellen werd tot 7 dagen lang beoordeeld.
Het microfluïdische platform werd continu doorstroomd met kweekmedium. Uit de resultaten bleek dat beide cellijnen na 7 dagen hun levensvatbaarheid behielden zonder dat er een collageenlaag nodig was (wat wel vereist is bij statische kweeksystemen).
Bovendien zorgde de hoge celdichtheid voor een hoge stofwisselingsactiviteit als gevolg van cel-celcontacten.
Uit het onderzoek blijkt hoe microfluïdische platforms zo kunnen worden ontworpen dat ze specifieke functies van een weefsel of orgaan nauwkeurig nabootsen. In dit onderzoek werd een microfluïdisch apparaat ontworpen, bestaande uit een stromingskanaal, een celgebied en een doorlaatbare, endotheelachtige barrière, om de omstandigheden van de microcirculatie in de lever na te bootsen, waardoor de levensvatbaarheid van de hepatocyten en de cel-celinteracties werden verbeterd.
Recensie geschreven door Alessandra Dellaquila.
Bronvermeldingen
[1] Y. B. Kang e.a., „Lever-sinusoïde op een chip: langdurige gelaagde co-cultuur van primaire hepatocyten en endotheelcellen van ratten in microfluïdische platforms“, Biotechnol. Bioeng., vol. 112, nr. 12, blz. 2571–2582, 2015.
[2] C. H. Beckwitt e.a., „Lever ‘organ on a chip’”, Exp. Cell Res., 2017.
[3] Y. Du e.a., „Het nabootsen van de sinusoïdale structuren en functies van de lever met behulp van een 3D-geconfigureerde microfluïdische chip”, Lab Chip, jaargang 17, nr. 5, blz. 782–794, 2017.
[4] L. A. Vernetti e.a., „Een microfysiologisch platform voor de menselijke lever voor onderzoek naar fysiologie, geneesmiddelenveiligheid en ziektemodellen“, Exp. Biol. Med., jaargang 241, nr. 1, blz. 101–114, 2016.
[5] V. Natarajan, E. N. Harris en S. Kidambi, “SEC’s (sinusoïdale endotheelcellen), de micro-omgeving van de lever en fibrose,” Biomed Res. Int., vol. 2017, 2017.
[6] S. S. Bale e.a., „In-vitroplatforms voor het beoordelen van levertoxiciteit“, Exp. Biol. Med., jaargang 239, nr. 9, blz. 1180–1191, 2014.
[7] A. J. Strain en J. M. Neuberger, „A bioartificial liver–state of the art“, Science (80-. ), vol. 295, nr. 5557, blz. 1005–1009, 2002.
[8] C. Moraes, G. Mehta, S. C. Lesher-Perez en S. Takayama, „Organs-on-a-Chip: A Focus on Compartmentalized Microdevices”, deel 40, 2011.
[9] H. Tsutsui en S. Nishiguchi, „Het belang van Kupffer-cellen bij het ontstaan van acute leverschade bij muizen”, deel 15, 2014.
[10] G. H. Underhill en S. R. Khetani, „Bio-engineered levermodellen voor het testen van geneesmiddelen en onderzoek naar celdifferentiatie”, Cell. Mol. Gastroenterol. Hepatol., jaargang 5, nr. 3, blz. 426–439, 2018.
[11] P. J. Lee, P. J. Hung en L. P. Lee, „Een kunstmatige leversinusoïde met een microfluïdische, endotheelachtige barrière voor de kweek van primaire hepatocyten“, Biotechnol. Bioeng., vol. 97, nr. 5, blz. 1340–1346, 2007.
