Liposomen of lipide-nanodeeltjes zijn gesloten blaasjes die op grote schaal worden gebruikt voor het inkapselen van verschillende soorten moleculen, zoals DNA, eiwitten, geneesmiddelen en/of andere chemische stoffen. In dit korte overzicht bespreken we de meest gebruikte bereidingsmethoden, met speciale aandacht voor microfluïdica.
Een liposoomschil is een fosfolipide dubbellaag die fungeert als een biomimetisch membraan dat een vloeibaar compartiment omsluit, zoals schematisch weergegeven in figuur 1. Dankzij hun uiterst hoge biocompatibiliteit vinden liposomen nuttige toepassingen op verschillende gebieden, en is de ontwikkeling van robuuste bereidingsmethoden van groot belang.
Ongeacht de bereidingswijze zijn fosfolipiden amfifiele moleculen die zich in waterige oplossingen spontaan tot liposomen organiseren vanwege hun hydrofobe aard. Dit proces vermindert de ongunstige interacties tussen de hydrofobe acylketens en de omringende waterige fase.
Afhankelijk van de specifieke methode die wordt gebruikt voor de bereiding van liposomen, kunnen de grootte, de lamellariteit en de dispersiteit van de verkregen liposomen sterk verschillen. De lipidevesikels die in medische toepassingen worden gebruikt, zijn doorgaans unilamellair en hebben een diameter van ~100 nm.
Microfluïdische apparaten voor de bereiding van liposomen
De oudste en meest traditionele methoden voor de bereiding van liposomen bestaan uit de zogenaamde macroscopische of batchtechnieken, die gebaseerd zijn op de aanvankelijke dehydratatie van lipidenfilms, gevolgd door het zwelproces en de uiteindelijke mechanische bewerking om de in water gedispergeerde dubbellaagjes te vormen. Deze methoden worden echter gekenmerkt door een slechte reproduceerbaarheid, beperkte procescontrole en een inefficiënt gebruik van materialen en reagentia.
Microfluïdica is recentelijk onderzocht als een efficiënte methode voor de bereiding van liposomen op een gecontroleerde, reproduceerbare en hoogdoorvoerbare manier. Microfluïdica maakt het mogelijk om de gebruikte volumes en de daarmee gepaard gaande kosten te verminderen door vloeistoffen te verwerken in geometrisch begrensde compartimenten die doorgaans worden gekenmerkt door lengteschalen in de micrometer en lage Reynoldsgetallen.
Druppelgenerator
Microfluïdische stroomfocusering is een van de eerste methoden die zijn geïntroduceerd en bestaat uit het gebruik van microfluïdische chips met een dwarsstroomgeometrie om ervoor te zorgen dat de centrale stroom van een alcoholische oplossing die de fosfolipiden bevat, en een waterige oplossing elkaar kruisen. Meestal komen drie stromen samen in hetzelfde microfluïdische kanaal, zoals weergegeven in figuur 2. Dit is het typische patroon van microfluïdische apparaten die geschikt zijn voor het genereren van druppeltjes (klik hier om enkele voorbeelden te bekijken). Zoals u kunt zien, wordt een alcoholische fosfolipidenoplossing in een centraal kanaal geïnjecteerd, geflankeerd door twee zijdelingse waterige oplossingen. De lipidenhoudende stroom wordt gefocust en dankzij 1) het lage Reynoldsgetal en 2) de diffusie die wordt gedomineerd door de massaoverdracht, diffundeert de alcohol in de waterige oplossing en begint de concentratie ervan in de centrale stroom af te nemen. Zodra een kritische concentratie wordt bereikt die onder de oplosbaarheid van de fosfolipiden ligt, organiseren deze zich spontaan tot liposomen via een zelfassemblageproces. De verhouding tussen de volumestroom van de lipidenstroom en die van de waterfase, samen met de totale stroomsnelheid, beïnvloedt de grootte van de verkregen liposomen; door deze verhouding aan te passen kan de bereiding gecontroleerd worden uitgevoerd.
De dubbele emulsie is een variant van de flow-focusing-methode en bestaat uit het vormen van een water-in-olie-in-water-emulsie, waarbij in de eerste stap een organische oplossing van tolueen en chloroform wordt gebruikt voor de verdamping van de oliefase. Zodra de oliefase is verwijderd, komen de fosfolipide-monolagen – die de interne en externe olie-watergrensvlakken vormen – in contact met de tweede waterige fase en vormen ze samen liposomen.
Deze methode is technisch uitdagend omdat hiervoor twee verschillende chips nodig zijn die achter elkaar zijn geschakeld, waarbij de eerste is voorzien van een hydrofobe coating en de tweede van een hydrofiele coating. De efficiëntie kan ook laag zijn als gevolg van de emulgeringsstap, waarbij de grootte van de vesikels en de bereidingssnelheid een sterke invloed hebben op 1) hun stabiliteit en 2) de fosfolipideconcentratie aan de olie-watergrensvlakken. Als de liposomen dus te klein zijn of te snel worden gevormd en de fosfolipiden nog niet gestabiliseerd zijn aan het grensvlak, hebben de druppeltjes de neiging om gemakkelijk te breken en hun inhoud vrij te geven, waardoor de inkapselingsefficiëntie afneemt.
Vissenbot-menger
Onlangs is micromixing volgens de Herringbone-methode onderzocht en deze methode blijkt grote voordelen te bieden ten opzichte van andere bereidingsmethoden wat betreft de efficiëntie van de liposomenproductie.
Zo zijn er bijvoorbeeld met succes PEG-gelabelde liposomen vervaardigd met behulp van een Herringbone-menger (klik hier voor meer informatie). Dit apparaat is een chaotische advectiemixer die de voor microkanalen kenmerkende laminaire stroming kan doorbreken en de tijd die nodig is voor het bereidingsproces van de liposomen kan verkorten. Het specifieke patroon van het apparaat, dat bestaat uit visgraatgroeven, zorgt voor een herverdeling van de vloeistoffen door een transversale stroming in het microkanaal te creëren.
The vertices of the grooves are offset to approximately one third of the width of the channel and two counter-rotating vortices are created by the grooves. The subsequent set of herringbone groves with a mirrored orientation of the vortices allows the creation of a full mixing cycle as shown in Fig.3. The alternation of these herringbone sets reorients the flow periodically and strongly improves the mixing. This microfluidic preparation method allows the controlled creation of liposomes of different sizes (∼100 nm) and good dispersity (< 0.2). By changing the flow rate parameters and the formulations in terms of aqueous buffer, phospholipid concentrations, and composition it is possible to finely tune the production of liposomes with the desired features.
Afsluitende overwegingen
Het is duidelijk dat microfluïdica eenvoordeelbiedt als methode voor de bereiding van liposomen voor tal van toepassingen. In vergelijking met de traditionele methoden op macroschaal of batchmethodenmaken microfluïdica-methoden een bereiding van liposomen met hoge doorvoercapaciteit mogelijk, op een goed gecontroleerde en reproduceerbare manier. Hoewel er snel vooruitgang is geboekt, zijn er nog steeds verdere verbeteringen nodig om microfluïdica te vestigen als de voorkeursmethode voor de bereiding van liposomen, zowel in het laboratorium als in de industrie.
Op dit moment zijn er twee belangrijke obstakels die de erkenning van microfluïdica als voorkeursmethode voor de bereiding van liposomen in de weg staan:
- Zoals Björnmalm et al. (2014) hebben aangetoond,is het voor onderzoekers zonder ervaring op het gebied van microfluïdica moeilijk om toegang te krijgen tot microfluïdische technologieën
- Carugo et al. (2016) en Sackmann et al. (2014) wijzen daarentegen ophet gebrek aan gedegen wetenschappelijke onderbouwing voor de manier waarop microfluïdica aan hun specifieke behoeften zou kunnen voldoen
Hopelijk kunnen de toenemende beschikbaarheid van innovatieve microfluïdische apparaten op de markt en de bereidheid van veel ervaren microfluïdici om kennis te delendeze leemtenuopvullenen de positie van microfluïdica als de voorkeursmethode ten opzichte van conventionele methoden versterken. Darwin Microfluidics zet zich in voor deze revolutie. Wij leveren innovatieve microfluïdische apparaten voor de bereiding van liposomen en ons team van ervaren wetenschappers en PhDs biedt de ondersteuning die onderzoekers nodig hebben om succesvol te zijn in hun werkzaamheden.
Bronvermeldingen
- Björnmalm M. e.a., Ontwerp en evaluatie van deeltjes voor medicijnafgifte in microfluïdische systemen. Journal of Controlled Release 2014, 190: 139.
- Cheung C. C.L. et al. – Jamal W. T. Productie van sterisch gestabiliseerde liposomen met behulp van een micromixer met verspringend visgraatpatroon: invloed van de lipidesamenstelling en het PEG-lipidegehalte. International Journal of Pharmaceutics 2019, 566: 687.
- Carugo D. e.a., Liposoomproductie met behulp van microfluïdica: mogelijkheden en beperkende factoren. Scientific Reports 2016, 6: 25876.
- Deshpande S.enDekker C. On-chip microfluïdische productie van liposomen ter grootte van een cel. Nature Protocols 2018, 13 (5): 856.
- Sackmann E.K. e.a., De huidige en toekomstige rol van microfluïdica in biomedisch onderzoek. Nature 2014, 507: 181.
- van Swaay D.enDeMello A. Microfluïdische methoden voor het vormen van liposomen. Lab on Chip 2013, 13: 752.
- Williams M. S. e.a., Een praktische handleiding voor de verspringende visgraatmenger. Lab on Chip 2008, 8 (7): 1121.
