De belangstelling voor de productie van lipide-nanodeeltjesis het afgelopen decennium toegenomen. Deze nanoliposomen bieden inderdaad tal van voordelen, zoals de mogelijkheid om verschillende therapeutische stoffen te combineren, de werkzame bestanddelen te beschermen tegen veranderingen, de verspreiding van stoffen in het lichaam te regelen, of zelfs de mogelijkheid tot volledige sterilisatie door filtratie.
Wat is een nanoliposoom?
Nanoliposomen of lipide-nanodeeltjesbestaan vaak uit één of meer lamellaire lagen. Deze lagen omvatten een fosfolipide-dubbellaag die een kleine hoeveelheid waterige vloeistof bevat. De diameter van nanoliposomen kan variëren van enkele tientallen nanometers tot honderden micrometers, afhankelijk van de methode die wordt gebruikt om ze te produceren.
Fosfolipiden en lipiden vormen de belangrijkste bestanddelen van liposomale membranen. Ze hebben de bijzonderheid dat ze oplosbaar zijn in diverse organische oplosmiddelen, en juist vanwege deze eigenschap maken de meeste huidige methoden in de eerste stap van het protocol gebruik van organische oplosmiddelen om de lipiden oplosbaar te maken.
De opkomst van microfluïdica opent nieuwe mogelijkheden voor de bereiding van op lipiden gebaseerde nanodeeltjes. Microfluïdische methoden hebben aangetoond dat ze niet alleen het mengproces van de organische en waterige fasen kunnen regelen, maar ook de grootte, waardoor een hoge monodispersiteit kan worden bereikt. Bovendien biedt dit de mogelijkheid om door middel van het ontwerp van de microfluïdische chip de samenstelling en grootte van de verkregen nanoliposomen te variëren.
Voordelen van het gebruik van microfluïdica bij de productie van nanoliposomen
De oudste en meest traditionele methoden voor de bereiding van liposomen bestaan uit de zogenaamde macroscopische of batchtechnieken, die gebaseerd zijn op de aanvankelijke dehydratatie van lipidenfilms, gevolgd door het zwelproces en de uiteindelijke mechanische bewerking om de in water gedispergeerde dubbellaagjes te vormen. Deze methoden worden echter gekenmerkt door een slechte reproduceerbaarheid, beperkte procescontrole en een inefficiënt gebruik van materialen en reagentia.
Microfluïdica is recentelijk onderzocht als een efficiënte methode voor de bereiding van liposomen op een gecontroleerde, reproduceerbare en op grote schaal uitvoerbare manier.
Microfluïdica maakt het mogelijk om de gebruikte volumes en de daarmee gepaard gaande kosten te verminderen door vloeistoffen te verwerken in ruimtes met strikte geometrische beperkingen, die doorgaans worden gekenmerkt door lengteschalen in de micrometer en lage Reynoldsgetallen.
Welke microfluïdische apparaten kunnen worden gebruikt voor de bereiding van nanoliposomen?
Sommige chips kunnen ook een specifieke behandeling ondergaan, die de grootte of samenstelling van de nanoliposomen beïnvloedt. In dit hoofdstuk zullen we daarom de verschillende bestaande geometrieën bekijken, evenals voorbeelden uit de literatuur, om de daaruit voortvloeiende toepassingen te beoordelen.
Mengapparaat met visgraatpatroon voor de productie van lipide-nanodeeltjes
Onlangs is micromixing volgens de Herringbone-methode onderzocht en deze methode blijkt, in vergelijking met andere bereidingsmethoden, grote voordelen te bieden wat betreft de efficiëntie van de liposomenproductie.
Zo zijn er bijvoorbeeld met behulp van een Herringbone-menger met succes PEG-gemodificeerde liposomen vervaardigd. Dit apparaat is een chaotische advectiemenger die de voor microkanalen kenmerkende laminaire stroming kan verstoren en de tijd die nodig is voor het bereidingsproces van de liposomen kan verkorten.
Het specifieke patroon van het apparaat, dat bestaat uit groeven in visgraatpatroon, zorgt voor een herverdeling van de vloeistoffen door een dwarsstroom in het microkanaal te creëren. De hoekpunten van de groeven zijn verschoven met ongeveer een derde van de breedte van het kanaal, waardoor er twee tegengesteld draaiende wervelingen ontstaan. De daaropvolgende reeks groeven in visgraatpatroon, waarbij de oriëntatie van de wervelingen gespiegeld is, maakt het mogelijk een volledige mengcyclus te creëren, zoals weergegeven in figuur 2.
The alternation of these herringbone sets reorients the flow periodically and strongly improves the mixing. This microfluidic preparation method allows the controlled creation of liposomes of different sizes (∼100 nm) and good dispersity (< 0.2). By changing the flow rate parameters and the formulations in terms of aqueous buffer, phospholipid concentrations and composition it is possible to finely tune the production of liposomes with the desired features.
Om dit ontwerp te illustreren, stelt het team van Leug et al. (2015) een algemene methode voor om macromoleculen (SiRNA) in te kapselen in een systeem van lipide-nanodeeltjes. Met behulp van een micromixer met visgraatpatroon konden zij nanodeeltjes met een diameter van 40 tot 140 nm produceren.
Er bestaan talrijke technieken, en dus ook talrijke geometrieën, waarmee u nanodeeltjes kunt genereren. De hier gepresenteerde informatie helpt u bij het kiezen van uw microfluïdische apparaat op basis van uw toepassingen en de grootte van de nanodeeltjes die u wilt genereren.
Druppelgenerator voor de productie van lipide-nanodeeltjes
Meestal komen drie stromen samen in hetzelfde microfluïdische kanaal, zoals te zien is in figuur 3. Dit is het typische patroon van microfluïdische apparaten die geschikt zijn voor het genereren van druppeltjes. Zoals je kunt zien, wordt een alcoholische fosfolipidenoplossing in een centraal kanaal geïnjecteerd, geflankeerd door twee waterige oplossingen aan weerszijden.
De lipidenhoudende stroom wordt gebundeld, en dankzij:
- Het lage Reynoldsgetal.
- De diffusie wordt gedomineerd door de massaoverdracht.
De alcohol verspreidt zich in de waterige oplossing en de concentratie ervan in de centrale stroom begint af te nemen. Zodra deze een kritische concentratie bereikt die lager ligt dan de oplosbaarheid van de fosfolipiden, organiseren deze zich spontaan tot liposomen via een zelfassemblageproces.
De verhouding tussen de volumestromen van de lipide- en de waterfase, in combinatie met de totale stroomsnelheid, is bepalend voor de grootte van de verkregen liposomen; door deze verhouding aan te passen kan de bereiding gecontroleerd worden uitgevoerd.
Ten slotte toonden Karnik c.s. in 2008 aan dat het mogelijk is om via stroomfocusering nanodeeltjes te genereren met een zeer hoge monodispersiteit. Het team slaagt er inderdaad in om nanodeeltjes met een diameter van 31 nm (± 1 nm) te produceren. De grootte varieert hierbij afhankelijk van de samenstelling van de nanodeeltjes.
Het Y-vormige microfluïdische apparaat voor de productie van lipide-nanodeeltjes
Met dit ontwerp kunnen twee vloeistoffen (meestal een waterige oplossing met oppervlakte-actieve stof en een lipideoplossing in combinatie met een oplosmiddel) met elkaar in contact worden gebracht, waarna nanoprecipitatie kan plaatsvinden in het opvangkanaal. Nanoprecipitatie is de aggregatie van nanodeeltjes in tijd en ruimte.
Het team van Roces et al. (2020) maakte gebruik van een Y-vormige micromixer om lipide-nanodeeltjes te ontwikkelen. Met dit apparaat werden nanodeeltjes met een diameter van 100 tot 200 nm geproduceerd. De grootte van deze nanodeeltjes neemt na filtratie aanzienlijk af, waardoor het mogelijk is om nanolipiden te verkrijgen met een grootte tussen 50 en 80 nm en een polydispersiteitsindex van 0,2.
Het 3D-coaxiale capillaire apparaat voor de productie van lipide-nanodeeltjes
Deze apparaten bieden de mogelijkheid om coaxiale 3D-stromingen te creëren, die essentieel zijn voor een snelle en gelijkmatige massaoverdracht. Het capillair microfluïdisch apparaat met gelijkstroom bestaat uit twee capillairen. Een taps toelopende glazen capillair is coaxiaal in een andere, grotere cilindrische capillair geplaatst. De binnenste vloeistof (een waterige oplossing met oppervlakte-actieve stof) stroomt door de binnenste cilindrische capillair, terwijl de buitenste vloeistof (een lipideoplossing gekoppeld aan een oplosmiddel) tussen de binnenste en buitenste cilindrische capillairen stroomt.
Met dit microfluïdische apparaat publiceerden Liu et al. in 2015 een artikel waarin zij de vorming beschreven van lipide-nanodeeltjes met een diameter tussen 70 en 280 nm en een polydispersiteitsindex van bijna 0,1. Deze grootte varieert als functie van het Reynoldsgetal vanwege de aanwezigheid van capillairen.
Afsluitende overwegingen
Er bestaan talrijke technieken, en dus ook talrijke geometrische vormen, waarmee je nanodeeltjes kunt genereren. De informatie die hier wordt gepresenteerd, helpt je bij het kiezen van je microfluïdische apparaat op basis van je toepassingen en de grootte van de nanodeeltjes die je wilt genereren.
Darwin Microfluidics zet zich volledig in voor deze revolutie. Wij leveren innovatieve microfluïdische apparaten voor de bereiding van liposomen en ons team van ervaren wetenschappers en PhDs biedt de ondersteuning die onderzoekers nodig hebben om succesvol te zijn in hun werkzaamheden.
🧠 Wat je moet onthouden
- Liposomen of lipide-nanodeeltjes zijn ingesloten blaasjes die op grote schaal worden gebruikt voor het inkapselen van verschillende soorten moleculen, zoals DNA, eiwitten, geneesmiddelen en/of andere chemische stoffen.
- Microfluïdische methoden bieden een alternatieve manier om lipide-nanodeeltjes te vervaardigen, waarbij de grootte en samenstelling beter kunnen worden geregeld.
- De verhoudingen tussen de stroomsnelheden van de lipide- en de waterfase, in combinatie met de totale stroomsnelheid, kunnen worden aangepast om liposomen met de gewenste grootte te verkrijgen.
- By adjusting parameters such as the flow rate and formulation components, it is possible to achieve precise control over the size (<100 nm) and dispersity (< 0.2) of the liposomes.
