In de biologie zijn sferoïden driedimensionale celaggregaten die de structuur en functie van weefsels nabootsen. In omgevingen waarin hechting aan oppervlakken wordt verhinderd, kunnen cellen zich inderdaad zelf ordenen tot bolvormige structuren, die sferoïden worden genoemd. De belangstelling voor deze structuren is de afgelopen jaren toegenomen, aangezien ze een 3D-model vormen dat dichter bij de in vivo micro-omgeving van cellen in een levend organisme ligt dan de klassieke 2D-celkweek. 3D-celkweek biedt tal van voordelen voor medisch onderzoek, zoals het creëren van meer voorspellende modellen ter ondersteuning van de ontwikkeling van nieuwe therapieën.In dit blogartikel gaan we in op de basisprincipes van de vorming van cellulaire sferoïden en verdiepen we ons in de vele toepassingen ervan.
Vorming van sferoïden – Hoe klonteren cellen samen?
Er zijn verschillende manieren om sferoïden te vormen, maar de biologische processen achter deze celclustering zijn vrij complex en omvatten verschillende cellulaire mechanismen. Het vereist inderdaad cel-celadhesie tussen naburige cellen via transmembraanreceptoren aan het celoppervlak, zogenaamde integrines, wat resulteert in de aggregatie van cellen. Dit leidt tot de ophoping van een ander eiwit, cadherine genaamd, dat betrokken is bij cel-celadhesie. Vervolgens vormen deze samengeklonterde cellen ‘tight junctions’, die de aanvankelijke cel-celadhesie versterken en tevens de verdichting van de sferoïde vergroten. Daarnaast vinden tijdens het proces van sferoïdevorming complexe processen plaats, zoals de hermodellering van het cytoskelet, de productie van de extracellulaire matrix (ECM) en andere intracellulaire signaaloverdracht.
Na de initiële vorming kunnen de sferoïden blijven groeien – met name tumorsferoïden – en kunnen ze wekenlang in kweek worden gehouden. Ze kunnen worden blootgesteld aan behandelingen en andere experimentele omstandigheden, waarop ze reageren door veranderingen in de cellulaire architectuur, de afscheiding van moleculen of ander cellulair gedrag. Na verloop van tijd ontstaat er een gradiënt van voedingsstoffen en zuurstof tussen de binnenste en buitenste cellaag. Normale cellulaire processen kunnen enige veranderingen ondergaan. Zo kan bijvoorbeeld de celproliferatiesnelheid worden beïnvloed in de cellen in de kern, die minder worden blootgesteld aan voedingsstoffen en zuurstof, wat kan leiden tot apoptose (geprogrammeerde celdood) of necrose (ongecontroleerde celdood).
Wat zijn de technieken om cellulaire sferoïden te vormen?
Verschillende celtypen hebben een verschillende neiging om sferoïden te vormen; daarom zijn er verschillende methoden ontwikkeld om celaggregatie te bevorderen. Hier volgt een (niet-uitputtende) lijst van deze technieken:
- Sommige celtypen kunnen van nature samenklonteren door de expressie van celadhesiemoleculen. Kankercellen klonteren bijvoorbeeld vaak vanzelf samen tot sferoïden, die uiteindelijk uitgroeien tot tumoren.
- Hoewel sommige cellen relatief geneigd zijn om aggregaten te vormen, kunnen ze ook baat hebben bij enige ondersteuning vanuit de omgeving. Deze ondersteuning kan worden geboden door de toevoeging van biochemische componenten die de cel-celadhesie bevorderen, zoals integrines, cadherines of componenten van de extracellulaire matrix en tal van andere moleculen.
- Het is ook mogelijk om coatings met een lage hechting of niet-hechtende coatings aan te brengen op de oppervlakken van het apparaat dat wordt gebruikt voor celaggregatie. Bovendien kan het fysiek beperken van de omgeving de vorming van sferoïden bevorderen door middel van een specifieke vorm van de putjes (zoals conische putjes met speciale richels die een vrijwel volledige mediumverversing mogelijk maken, zoals te zien is op deAKURA-microplaten vanInSphero ) of door middel van micropatterning met specifieke patronen op het oppervlak om de celaggregatie te sturen.
- Door cellen door middel van roeren in suspensie te houden, kan worden voorkomen dat ze zich aan het oppervlak hechten en worden cel-celcontacten bevorderd. Hoewel dit vrij eenvoudig te realiseren is, leidt het vaak tot grote variatie in de grootte van de sferoïden.
- Ook elektrische en magnetische velden, ultrageluid of akoestische golven kunnen worden gebruikt om de vorming van celclusters te bevorderen.
- Microfluïdica kan ook worden gebruikt om celaggregaten te vormen, wat verschillende voordelen biedt: er zijn minder reagentia nodig, de omgeving is goed gecontroleerd, de groottehomogeniteit tussen sferoïden van dezelfde en verschillende batches is verbeterd, en de modellering en celviabiliteit zijn beter dankzij de vloeistofdynamica.
- Een andere veelgebruikte methode is de‘hanging drop’-methode. Hierbij wordt gebruikgemaakt van de zwaartekracht om cel-celinteracties te bevorderen in een zwevende druppel medium. Hoewel dit op het deksel van een petrischaal kan worden gedaan, zijn er ook apparaten speciaal ontwikkeld om de reproduceerbaarheid en de productie op grote schaal van deze zwevende druppels te verbeteren.
Overzicht van technieken
| Techniek | Beschrijving |
|---|---|
| Natuurlijke aggregatie | Expressie van celadhesiemoleculen. |
| Biochemische componenten | De cel-cel-adhesie bevorderen. |
| Coatings met geringe hechting of niet-hechtende coatings | De vorming van sferoïden bevorderen. |
| Beperkende omgeving | Het sturen van celaggregatie door middel van specifieke putvormen of micropatronen. |
| Suspensie en roeren | Voorkom dat cellen zich aan het oppervlak hechten en bevorder cel-celcontacten. |
| Fysische velden | Bevorder de clustervorming van cellen door gebruik te maken van elektrische en magnetische velden, ultrageluid of akoestische golven. |
| Microfluïdica | Het vormen van celaggregaten in gecontroleerde omgevingen. |
| Hangende druppel | Gebruikmaken van de zwaartekracht om cel-celinteracties te bevorderen in een zwevende druppel medium. |
Welke andere factoren kunnen de celaggregatie beïnvloeden?
- De celdichtheidspeelt een rol en het is belangrijk om voor een bepaald volume het optimale aantal cellen te bepalen, zodat effectieve cel-celinteracties worden bevorderd en de vorming van sferoïden succesvol verloopt. Als er te weinig cellen zijn, kunnen er onvoldoende cel-celcontacten ontstaan, wat leidt tot slechte aggregatie. Te veel cellen daarentegen kunnen leiden tot een slechte toegang tot voedingsstoffen, celstress en uiteindelijk celsterfte. Een constante celdichtheid draagt bovendien bij aan homogene en uniforme sferoïden, wat de reproduceerbaarheid van experimenten ten goede komt.
- Celkweeken omgevingsomstandigheden:alle factoren die van belang zijn voor de levensvatbaarheid en groei van cellen, hebben ook invloed op de vorming van sferoïden. Het is inderdaad belangrijk om te zorgen voor voldoende voedingsstoffen en zuurstof, een optimale temperatuur, pH-waarde en CO₂-gehalte, en een medium dat qua samenstelling geschikt is voor het gekozen celtype. Als de omstandigheden niet optimaal zijn, kan dit de interacties en communicatie tussen cellen beïnvloeden en celstress veroorzaken, wat zelfs tot celdood kan leiden. Metabolieten die door cellen binnen de sferoïde worden geproduceerd, beïnvloeden ook andere cellen. Met name de metabolieten die worden geproduceerd door de cellen in het centrum van de sferoïde, bereiken mogelijk de cellen in de buitenste lagen niet, waardoor cellen niet worden blootgesteld aan dezelfde metabolieten of concentraties daarvan, afhankelijk van waar ze zich in de sferoïde bevinden. Dit heeft invloed op de intercellulaire communicatie en kan ook een rol spelen in de verschillende stappen van de sferoïdevorming. Mechanische krachten en omstandigheden dragen eveneens bij aan de vorming van sferoïden, ongeacht of deze van natuurlijke oorsprong zijn of worden bepaald door de gekozen aggregatiemethode.
- Adhesiemoleculen en componenten van de extracellulaire matrixspelen een belangrijke rol bij celadhesie en celaggregatie. Het stimuleren van de expressie van deze moleculen kan ook een regelparameter zijn.
Welke soorten cellulaire sferoïden zijn er?
Er bestaan veel soorten sferoïden, die elk een unieke bijdrage leveren aan het onderzoek:
Multicellulaire tumorsferoïden (MCTS)
Multicellulaire tumorsferoïden (MCTS) spelen een cruciale rol bij het modelleren van solide tumoren. Deze sferoïden, die een tussenvorm vormen tussen 2D-kweek en in vivo tumoren, bootsen essentiële kenmerken van tumoren na, zoals de vorming van voedingsgradiënten en de ontwikkeling van een hypoxische kern met minder zuurstoftoevoer, maar ook fysiologische intercellulaire communicatie en cellulaire heterogeniteit. Door de tumor-micro-omgeving nauwkeurig na te bootsen, zijn MCTS onmisbaar voor het bestuderen van de biologie van kanker en het testen van antikankertherapieën.
Bron: Kamatar, A.; Gunay, G.; Acar, H. Natuurlijke en synthetische biomaterialen voor het ontwikkelen van multicellulaire tumorsferoïden. Polymers 2020, 12, 2506.
Stamcel-sferoïden
Ze zijn afgeleid van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC’s) en beschikken over het opmerkelijke vermogen om zich te differentiëren tot verschillende celtypen. Deze veelzijdigheid maakt ze tot een hoeksteen van het onderzoek op het gebied van regeneratieve geneeskunde en weefselengineering. Deze sferoïden bieden inzicht in het gedrag van stamcellen en mogelijke therapeutische toepassingen.
Embryoïde cellen (EB’s)
Embryoïde cellen (EB’s), die onder de vorige categorie vallen, worden gevormd uit embryonale stamcellen (ESC’s) en iPS-cellen. Ze worden gebruikt om de vroege embryonale ontwikkeling te bestuderen. Ze kunnen ook dienen als model voor weefselengineering, regeneratieve geneeskunde en de specificatie van cellijnen.
Fasebeeld van embryoïde lichamen (EB’s) in suspensiecultuur, 24 uur na vorming. De EB’s werden gevormd uit ongeveer 1000 embryonale stamcellen van de muis (D3-cellijn). Schaalbalk = 100 µm.
Bron: Embryoïde lichaam. (22 juni 2024). In Wikipedia.
Weefselspecifieke sferoïden
Het gaat hierbij vaak om sferoïden uit gemengde culturen, die uit meerdere celtypen bestaan om de complexiteit van weefsels na te bootsen, aangezien deze doorgaans niet uit slechts één celtype bestaan. Deze sferoïden vergemakkelijken het onderzoek naar cel-celinteracties, weefselengineering en het modelleren van ziekten. Ze bieden een fysiologisch relevanter model doordat ze diverse celtypen bevatten die binnen een weefsel met elkaar interageren.
Lever-sferoïden
Deze sferoïden, die bestaan uit levercellen (hepatocyten, niet-parenchymale cellen en leverstercellen), worden gebruikt om de leverfunctie en leveraandoeningen te modelleren, het metabolisme van geneesmiddelen te bestuderen en toxiciteitstests uit te voeren. Ze kunnen leerspecifieke activiteiten nabootsen, waardoor ze een waardevol hulpmiddel vormen voor leveronderzoek.
Neurosferen
Neurosferen, afgeleid van neurale stamcellen of voorlopercellen, worden gebruikt voor onderzoek naar neurogenese, neurale differentiatie, neurodegeneratieve aandoeningen en neurale weefselengineering. Ze bieden een dynamisch model om de complexiteit van het zenuwstelsel te onderzoeken.
Cardiosferen
Cardiosferen, die bestaan uit cardiale voorlopercellen, spelen een cruciale rol in onderzoek naar hartregeneratie, modellen voor hartziekten en tests op cardiotoxiciteit. Ze bootsen de micro-omgeving van het hart na en bieden zo inzicht in het herstel van hartweefsel en de mechanismen van hartziekten.
Adiposferen
Adiposferen, die worden gevormd uit vetweefselcellen, worden gebruikt voor onderzoek naar adipogenese, obesitas, stofwisselingsziekten en het testen van geneesmiddelen. Ze bootsen het gedrag en de functie van vetweefsel na, waaronder vetopslag en hormoonafscheiding.
In navolging van de hierboven beschreven voorbeelden is het denkbaar dat er sferoïden voor alle organen van het lichaam kunnen worden ontwikkeld, mits de optimale experimentele omstandigheden kunnen worden vastgesteld en er vergelijkende studies met bestaande modellen en in vivo-onderzoeken worden uitgevoerd om de relevantie van het model te valideren.
Immuunsferoïden
Deze aggregaten bevatten immuuncellen, zoals lymfocyten en macrofagen, en worden gebruikt voor onderzoek naar immuunreacties, immuuntherapie en interacties tussen tumoren en het immuunsysteem. Ze zijn van essentieel belang om inzicht te krijgen in hoe immuuncellen met andere celtypen interageren en hoe deze interacties het ziekteverloop en de behandelingsresultaten beïnvloeden.
Vasculaire sferoïden
Ze beschrijven sferoïden uit de bovengenoemde categorieën die vasculaire componenten bevatten of die zijn afgeleid van endotheelcellen. Ze kunnen worden gebruikt bij onderzoek naar angiogenese, vasculaire biologie en het testen van geneesmiddelen in verband met de vorming van bloedvaten. Deze sferoïden dragen bij aan het inzicht in de vorming en functie van bloedvaten, wat van cruciaal belang is voor weefselengineering en kankeronderzoek. Vascularisatie is essentieel voor de toevoer van voedingsstoffen en het overleven van cellen en is daarom ook van cruciaal belang voor de ontwikkeling van relevante en fysiologische sferoïdemodellen van verschillende weefseltypen.
Tumorsferoïde en vasculair netwerk gerealiseerd in een microfluïdisch apparaat.
Bron: Nashimoto Y, Okada R, Hanada S, Arima Y, Nishiyama K, Miura T, Yokokawa R. Vascularized cancer on a chip: The effect of perfusion on growth and drug delivery of tumor spheroid.
Biomaterials. januari 2020;229:119547.doi: 10.1016/j.biomaterials.2019.119547. Epub 17 oktober 2019. PMID: 31710953.
Hoe kunnen spheroïden worden toegepast in medisch onderzoek?
De ontwikkeling van sferoïde culturen heeft het medisch onderzoek een geheel nieuwe dimensie gegeven. Deze celaggregaten vormen betrouwbare en kosteneffectieve modellen om inzicht te krijgen in ziektemechanismen, biologische processen en de werkzaamheid en toxiciteit van behandelingen. Ze vormen een nieuw in-vitro-model en een alternatief voor dierproeven voor een betere voorspelbaarheid en een verbeterde vertaling naar klinische proeven bij mensen.
| Toepassing | Functie |
|---|---|
| Drugstest | Wordt gebruikt voor het onderzoeken van zowel de toxiciteit als de werkzaamheid van nieuw ontwikkelde moleculen en reeds toegelaten geneesmiddelen, ter ondersteuning van het herbestemmen van geneesmiddelen. |
| Ziektemodellering | Zorgen voor een beter begrip van ziektemechanismen en het ophelderen van biologische processen. |
| Gepersonaliseerde geneeskunde | Kan worden gebruikt om voor individuele patiënten de meest efficiënte behandeling te vinden. |
| Kankeronderzoek | Een superieur in-vitro-model voor tumoren bieden in vergelijking met 2D-celculturen, wat bijdraagt aan het onderzoek naar tumorinvasie, metastase en de ontwikkeling van behandelingen tegen kanker. |
| Weefselengineering | Ze worden gebruikt als bouwstenen om grotere 3D-structuren te ontwikkelen door meerdere sferoïden samen te voegen. Ze kunnen ook worden gebruikt voor het herstellen of vervangen van beschadigd weefsel. |
| Celtherapie | Wordt gebruikt om cellen op fysiologische wijze toe te dienen bij de ontwikkeling van celtherapieën. |
Er kunnen en zullen in de toekomst waarschijnlijk nog veel andere manieren worden gevonden om sferoïden in onderzoek en therapie toe te passen, vooral als de huidige nadelen van sferoïden kunnen worden beperkt.
Wat zijn de beperkingen van het gebruik van cellulaire sferoïden?
Ondanks de cruciale rol die sferoïde-kweek speelt in het hedendaagse biomedische onderzoek, kent deze methode nog steeds enkele beperkingen:
📏 Beperkingen qua omvang en reproduceerbaarheid
Hoe groter een sferoïde is, hoe meer deze wordt blootgesteld aan nutriëntengradiënten en daarmee aan mogelijke celnecrose in de kern. Daarnaast is het belangrijk om een productiemethode te ontwikkelen die een goede homogeniteit van de sferoïden oplevert, zodat resultaten van verschillende sferoïden met elkaar kunnen worden vergeleken. Het is ook belangrijk om te streven naar gestandaardiseerde methoden om reproduceerbare gegevens te verkrijgen.
🤖Automatisering en schaalbaarheid
Hoewel er op dit gebied veel innovaties opduiken, is het belangrijk om geautomatiseerde systemen te ontwikkelen voor de productie en het onderzoek naar sferoïden, zodat deze op grote schaal kunnen worden ingezet voor medisch onderzoek.
🧑🔬 Technische expertise
In het begin kan de overstap van 2D naar 2D enige aanpassing van de laboratoriumapparatuur en technische training vereisen.
🔎Beperkte analyse
Vanwege hun 3D-structuur kunnen bepaalde eindpunten, zoals beeldvorming, een uitdaging vormen. Het kan moeilijk zijn om toegang te krijgen tot de kern van de sferoïde, waardoor de analyse mogelijk beperkt blijft tot de buitenste lagen.
🧩 Beperkte complexiteit
Hoewel sferoïden complexer zijn dan 2D-monolaagjes, zijn ze qua structuur, vascularisatie, aantal celtypen en functies nog steeds minder complex dan natuurlijk weefsel.
Conclusie
Cellulaire sferoïden vertonen veelbelovende eigenschappen voor onderzoek dat fysiologischer, voorspellender en efficiënter is. Door hun toepassing op tal van gebieden vormen ze een veelzijdig en waardevol hulpmiddel voor onderzoekers en medische professionals. De voortdurende innovatie op het gebied van sferoïden in de afgelopen jaren biedt bovendien veelbelovende inzichten in mogelijke toekomstige verbeteringen.
Bronnen:
Białkowska K, Komorowski P, Bryszewska M, Miłowska K. Sferoïden als een vorm van driedimensionale celculturen – voorbeelden van bereidingsmethoden en de belangrijkste toepassing. Int J Mol Sci. 28 augustus 2020;21(17):6225. doi: 10.3390/ijms21176225. PMID: 32872135; PMCID: PMC7503223.
Decarli MC, Amaral R, Santos DPD, Tofani LB, Katayama E, Rezende RA, Silva JVLD, Swiech K, Suazo CAT, Mota C, Moroni L, Moraes ÂM. Celsferoïden als veelzijdig onderzoeksplatform: vormingsmechanismen, productie op grote schaal, karakterisering en toepassingen. Biofabrication. 8 april 2021;13(3). doi: 10.1088/1758-5090/abe6f2. PMID: 33592595.
Lazzari G., Couvreur P. & Mura S. (2017). Multicellulaire tumorsferoïden: een relevant 3D-model voor preklinisch onderzoek in vitro naar nanogeneesmiddelen op basis van polymeren. Polym. Chem. 8, 4947.
