Een op microfluïdica gebaseerde hydrodynamische val maakt het mogelijk om deeltjes vast te houden uitsluitend door middel van de vloeistofstroming en biedt een haalbaar alternatief voor bestaande technieken voor het vasthouden en manipuleren van deeltjes die bijvoorbeeld gebaseerd zijn op elektrische, optische, magnetische of akoestische krachtvelden. In dit overzicht beschrijven we diverse methoden en technieken die worden toegepast bij het vasthouden van sferoïden en deeltjes met een „ single-cell ” in microfluïdica.
Single-cell vangstprocessen
Een van de meest betrouwbare methoden om populaties van afzonderlijke cellen met een relatief hoge doorvoercapaciteit te analyseren, zijn microwell-arrays.
Een terugkerend probleem is echter dat microwell-culturen statisch zijn. Dit beperkt de mogelijkheden om de ingesloten cellen actief te manipuleren, bijvoorbeeld om het medium te verversen of de blootstelling van de cellen aan mitogene prikkels te regelen. Daarentegen bieden microfluïdische kleppen, optische pincetten, diëlektroforese (DEP) en akoestische golven – die eenvoudig in microfluïdische systemen kunnen worden geïntegreerd – krachtigere methoden om individuele cellen in te sluiten en te manipuleren.
In dit overzicht hebben we ervoor gekozen om uit te gaan van het onderzoek van Koben et al. uit 2018, waarin zij de vasthoudkracht konden beoordelen op basis van verschillende chipontwerpen. In hun studie presenteren Koben et al. een microfluïdisch apparaat dat in staat is om een enkele cel vast te houden via een netwerk van vallen, waarbij de lengte van het hoofdkanaal 1, 2 of 4 mm kan bedragen, met respectievelijk 64 vallen in parallel en 3 tot 10 vallen in serie. Elke chip heeft vervolgens twee inlaten: één voor het toedienen van medium en één voor het laden van cellen.
In de praktijk werd de chip eerst gevuld met compleet celkweekmedium bij een stroomsnelheid van 25 ml/min en werden de cellen via de reservetoevoeropening geïnjecteerd. Nadat de celinlaat met een stop was afgesloten, werd de chip op een omgekeerde microscoop geplaatst, geïnfuseerd met een stroomsnelheid van 20 nl/min en werd de verhouding tussen succesvolle en mislukte vangsten gekwantificeerd. Om een voldoende groot aantal vangstgebeurtenissen te kunnen analyseren voor statistische analyse, werden de reeds gevangen cellen uit de vallen verwijderd door de stroomrichting gedurende ongeveer 1,5 tot 2 s om te keren en de infusie opnieuw te starten.
Er is nog een ander slim apparaat ontworpen waarmee een volbloedmonster kan worden ingebracht (afb. 1 B). Het bestaat uit een volbloedingang, een bufferingang en een vertakkingsgebied, dat uitmondt in drie verzamelgebieden voor bloedcomponenten: een plasmagebied, een gebied voor rode bloedcellen (RBC) en een gebied voor witte bloedcellen (WBC). Het scheidingsmechanisme voor rode en witte bloedcellen is gebaseerd op de vertakkingswet en de cross-flow (zoutoplossing)-methode. Het vertakkingsgebied bevat zes met bolletjes gevulde zijkanalen, vier versmalde zijkanalen en één hoofdkanaal voor respectievelijk plasma-extractie, extractie van rode bloedcellen en het opvangen van witte bloedcellen. Om een uniform stromingsprofiel in het vertakkingsgebied te verkrijgen, zijn alle zijkanalen onder een hoek van 60 graden ten opzichte van het hoofdkanaal geplaatst.
Rode bloedcellen hebben doorgaans een diameter van 6,2-8,2 μm en een dikte van 2-2,5 μm, terwijl witte bloedcellen een diameter van 7-18 μm hebben. Door de dichtheid van de bolletjes van 10 μm in het zijkanaal bedraagt de effectieve poriëngrootte 1,55 μm. Daardoor zouden alle bloedcellen erdoorheen gaan en kan alleen plasma in het plasmagebied circuleren en worden opgevangen.
Processen voor het opvangen van sferoïden
U-vormige microstructuren
De U-vormige microstructuren werken ofwel tijdelijk, door middel van pneumatische aandrijving, ofwel permanent binnenin het apparaat. Veel van deze U-vormige microstructuren zijn doorgaans geïntegreerd. De diameter van de bolletjes hangt af van de grootte van de microstructuur, terwijl de onderlinge positie van de microstructuren essentieel is voor een effectieve celopvang.
Bovendien is het mogelijk om de tijd die nodig is voor de vorming van sferoïden te beïnvloeden door middel van het debiet. Hoge debieten zorgen er echter voor dat de cellen uit de val ontsnappen. Om de sferoïden daarentegen binnen de microstructuren te houden, moet de stroming in stand worden gehouden, zodat de benodigde stagnatiedruk behouden blijft.
Op microwells gebaseerde microfluïdische chips voor de vorming van sferoïden (µSFC)
Over het algemeen vereist een op microwells gebaseerde µSFC een bepaald aantal microwells en een microkanaalnetwerk voor de toevoer van het kweekmedium. De microkanalen moeten zo worden ontworpen dat wordt voorkomen dat ongewenste sferoïden uit de microwells ontsnappen. Uit experimenten is gebleken dat het vergroten van de kanaalbreedte of het verkleinen van de kanaalhoogte het ontsnappen van sferoïden kan beperken.
Om de stroomsnelheden in verschillende microkanalen gelijk te maken, moet de stromingsweerstand in alle kanalen gelijk zijn. Als de kanalen dezelfde breedte en hoogte hebben, moeten hun lengtes daarom ook gelijk zijn om aan deze eis te voldoen. Kronkelige kanalen, die vaak in concentratiegradiëntgeneratoren (CGG's) als mengkanalen worden gebruikt, zijn geschikt om de kanaallengte nauwkeurig aan te passen binnen een klein gebied van de chip. Dergelijke kanalen kunnen dus worden toegepast voor stromingsregeling, in plaats van kleppen in microfluïdische chips op te nemen. Bij het bepalen van de gewenste stroomsnelheden moet ook rekening worden gehouden met het aantal cellen in de kweekomgeving en hun bijbehorende behoeften aan zuurstof, voedingsstoffen en andere factoren.
Er bestaan talrijke apparaten waarmee georganiseerde cellen, zogenaamde sferoïden of organoïden, kunnen worden opgevangen. In figuur 3 laten we enkele van deze apparaten zien.
