In questo tutorial illustriamo in dettaglio tutte le fasi necessarie alla realizzazione di un dispositivo microfluidico, prendendo come esempio un chip a doppia emulsione e a intrappolamento. Questo protocollo, ispirato e tratto dagli articoli di Ho, Lee e Liu pubblicati nel 2016 su *Scientific Reports* e da Kole et al. pubblicati nel 2015 su *J. Res. Natl. Inst. Stand. Technologie, vi fornirà le indicazioni necessarie, dalla progettazione alla microfabbricazione, per costruire il vostro dispositivo.
Progettazione di un dispositivo
Il progetto presentato di seguito è stato concepito per generare goccioline a doppia emulsione.
Di seguito è riportato un protocollo dettagliato (tratto da Kole et al., pubblicato nel 2015 su J. Res. Natl. Inst.) che vi consentirà di progettare un dispositivo microfluidico:
1. Innanzitutto, è necessario utilizzare un software di progettazione assistita da computer (CAD) per progettare il dispositivo microfluidico.
2. Successivamente, vi consigliamo di utilizzare il contorno di un wafer del diametro di 100 mm (ovviamente questo dipende dalle dimensioni del vostro dispositivo) e una superficie piana standard come limite esterno del dispositivo a matrice, e di disporre gli elementi del dispositivo al centro, a circa 90 mm dal centro del wafer, per evitare possibili difetti ai bordi.
3. Per realizzare un dispositivo con diversi livelli litografici, che richiede l'applicazione di fotoresist sugli elementi modellati e l'allineamento tra i livelli litografici successivi, si raccomandano le seguenti indicazioni:
3.1. È possibile posizionare le caratteristiche del dispositivo, come i segni di allineamento inferiori del substrato, sul primo livello di progettazione. Questa disposizione è ottimale per la strutturazione di elementi con dimensioni verticali dell'ordine dei nanometri in un film di fotoresist piatto, applicato in modo conforme su un substrato non strutturato.
Se le dimensioni verticali degli elementi strutturati nei livelli fotolitografici successivi sono critiche e se la progettazione del dispositivo e dell’array lo consente, posizionare gli elementi sui livelli inferiori verso la periferia dell’array. Tale posizionamento ridurrà quindi la variazione dello spessore del film di fotoresist depositato per via centrifuga su questi elementi dei livelli inferiori nelle posizioni più vicine al centro del wafer, dove verranno poi posizionati gli elementi dei livelli superiori.
3.2 Successivamente, i segni di allineamento inferiori dovrebbero essere posizionati verso la periferia del wafer per migliorare l’allineamento angolare e ridurre la conseguente variazione radiale dello spessore del film, nonché in punti che non interferiscano con le caratteristiche del dispositivo. Il posizionamento ideale dei segni di allineamento inferiori consente l’uso di un unico nastro lineare per mascherare più segni di allineamento inferiori durante il rivestimento centrifugo del fotoresist senza coprire le caratteristiche del dispositivo. Ciò mantiene la visibilità dei segni di allineamento inferiori, consentendo al contempo di raggiungere livelli più elevati di fotolitografia. Si raccomanda di includere almeno una coppia di segni di allineamento inferiori per ogni livello superiore di fotolitografia.
3.3. In questa terza fase, è possibile posizionare elementi del dispositivo quali canali microfluidici, serbatoi di ingresso e di uscita e segni di allineamento della fotomaschera superiore sui livelli di progettazione superiori. Se le dimensioni verticali di questi elementi sono critiche e se la progettazione del dispositivo e del die lo consente, è possibile posizionare questi elementi di livello superiore più vicini al centro del wafer. Questo posizionamento trarrà vantaggio dalla ridotta variazione dello spessore dello strato dovuta all’applicazione di un fotoresist centrifugo agli elementi di livello inferiore, che sono posizionati in modo ottimale verso la periferia del die. Pertanto, i segni di allineamento inferiori sul substrato dovrebbero essere visibili attraverso i segni di allineamento superiori sulla fotomaschera, che saranno per lo più opachi per modellare una struttura a stampo in un fotoresist a tono negativo.
4. Infine, durante il processo di fotolitografia, è possibile allineare i segni di allineamento complementari attraverso la fotomaschera sul substrato.
Realizzazione del modello per lo stampo di un dispositivo
Esistono molti approcci possibili per la realizzazione di uno stampo per un dispositivo microfluidico, utilizzando materiali e metodi diversi. Il più diffuso è l’approccio fotolitografico, particolarmente adatto alla prototipazione rapida. Consiste nel rivestire e modellare centrifugamente l’SU-8, un fotoresist negativo a base epossidica, su un wafer di silicio. Lo stampo in silicio per il substrato superiore è stato realizzato mediante patterning a doppio strato di SU-8, in cui il primo strato modellato definisce la sezione trasversale delle micropipette, delle strutture di intrappolamento e del canale microfluidico, mentre il secondo strato definisce le strutture di intrappolamento e il canale microfluidico principale. Lo stampo in silicio per il substrato inferiore è stato realizzato mediante patterning a singolo strato di SU-8, che definisce le strutture di intrappolamento e il canale microfluidico principale.
Stampo in silicio per il substrato superiore
1. La prima fase consiste nell'applicazione mediante spin-coating di un film nanometrico di SU-8 2010 su un wafer di silicio grezzo.
1.1. A tal fine, centrare il wafer di silicio sul mandrino di una centrifuga con l'ausilio di una dima di centraggio.
1.2 Versare circa 10 ml di SU-8 2010 al centro del wafer, facendo attenzione a non formare bolle d'aria.
1.3. Il primo strato del substrato superiore, SU-8 2010, è stato applicato su un wafer di silicio mediante rivestimento a rotazione a 5000 giri/min, ottenendo uno spessore di 8 µm.
2. Riscaldare il wafer di silicio ricoperto da uno strato nanometrico di SU-8 2010 a 95 °C per 2 minuti su una piastra riscaldante.
3. Occorre quindi procedere alla prima esposizione fotolitografica del film nanometrico SU-8 2010.
3.1. A tal fine, posizionare il wafer di silicio con il film nanometrico di SU-8 2010 e la prima fotomaschera nell’allineatore a contatto.
3.2. Posizionare il wafer di silicio con il film nanometrico di SU-8 2010 e la fotomaschera in contatto leggero.
3.3. Utilizzare un filtro i-line per esporre il film nanometrico SU-8 2010 a una lunghezza d'onda di 365 nm con una dose di 80 mJ·cm⁻².
4. Dopo l'esposizione, sottoporre nuovamente a cottura il wafer di silicio con lo strato nanometrico di SU-8 2010 su una piastra riscaldante a 95 °C per 2 minuti.
5. Il motivo può ora essere sviluppato nel film nanometrico di SU-8 2010 lasciato scoperto.
5.1. A tal fine, immergere il wafer di silicio con lo strato nanometrico esposto di SU-8 2010 nello sviluppatore SU-8 per 1 minuto, agitando delicatamente.
5.2. Successivamente, sciacquare il wafer di silicio con le strutture sviluppate in SU-8 2010 in alcool isopropilico per 10 secondi e asciugarlo con azoto.
6. Cuocere il wafer di silicio con i motivi sviluppati in SU-8 2010 su una piastra riscaldante a 150 °C per 30 minuti. Questi motivi aderiscono saldamente al substrato.
7. Mascherare le aree del wafer di silicio con i segni di allineamento inferiori realizzati con SU-8 2010 utilizzando, ad esempio, una striscia di nastro adesivo di larghezza pari a 6 mm (0,25 pollici). Questo nastro adesivo coprirà i segni di allineamento inferiori durante il processo di rivestimento centrifugo. Non coprire le aree del wafer di silicio in cui verranno realizzate le strutture del dispositivo di livello superiore, poiché ciò impedirebbe la fotolitografia in tali aree.
8. È ora possibile applicare mediante spin-coating il secondo strato di SU-8 2010 sul wafer di silicio mascherato con i primi motivi realizzati in SU-8 2010.
8.1. A tal fine, centrare il wafer di silicio con i pattern SU-8 2010 sul mandrino di una centrifuga con l'ausilio di una dima di centraggio.
8.2 Versare circa 10 ml di SU-8 2010 al centro del wafer, facendo attenzione a non formare bolle d'aria.
8.3 Per il secondo strato, si applica SU-8 2010 con una velocità di rotazione di 2000 giri/min, ottenendo uno spessore totale di 15 µm
9. Ora puoi rimuovere il nastro adesivo
10. Cuocere la cialda ricoperta da un film sottilissimo di SU-8 2010 su una piastra riscaldante a 95 °C per 8 minuti.
11. Ora è possibile procedere alla seconda esposizione fotolitografica della pellicola microscopica di SU-8 2010.
11.1. A tal fine, posizionare il wafer di silicio con il film su microscala di SU-8 2010 nell’allineatore a contatto insieme alla seconda fotomaschera per le caratteristiche su microscala del dispositivo.
11.2. Allineare i segni nanometrici tracciati in precedenza con i segni microscopici presenti sulla fotomaschera. Assicurarsi di allineare i segni di allineamento superiori e inferiori.
11.3. Posizionare il wafer di silicio con il film su microscala di SU-8 2010 e la fotomaschera in contatto morbido.
11.4. Utilizzare un filtro i-line per esporre la pellicola di SU-8 2010 a una lunghezza d'onda di 365 nm con una dose di 160 mJ/cm².
12. Dopo l'esposizione, cuocere il wafer di silicio con lo strato microscopico di SU-8 2010 esposto sulla piastra riscaldante a 95 °C per 8 minuti.
13. È ora giunto il momento di sviluppare il disegno sulla pellicola microscopica esposta di SU-8 2010.
13.1. A tal fine, preparare due contenitori per lo sviluppo dell’SU-8 per una prima rimozione in massa dell’SU-8 2010, seguita da un risciacquo di pulizia.
13.2 Immergere il wafer con lo strato microscopico di SU-8 2010 esposto nel primo contenitore per 45 secondi, agitando delicatamente.
13.3 Immergere il wafer con la pellicola microscopica di SU-8 2010 parzialmente sviluppata nel secondo contenitore, agitando delicatamente per 30 secondi.
13.4. Sciacquare il wafer, su cui è stato formato uno strato microscopico di SU-8 2010 completamente sviluppato, con alcol isopropilico e asciugarlo con azoto.
14. Esaminare lo stampo del dispositivo ottenuto al microscopio ottico. Se permangono residui di SU-8 2010, sciacquare il wafer.
Stampo in silicio per il substrato inferiore
Per il substrato inferiore, è stato realizzato un singolo strato di SU-8 2010 con uno spessore di 15 µm, utilizzando una velocità di rotazione di 1500 giri/min.
Si raccomanda di misurare lo spessore dello strato degli elementi modellati del SU-8 2010 utilizzando, ad esempio, un profilometro a sonda a scansione o un microscopio a forza atomica.
Realizzazione di un dispositivo
Una volta realizzati gli stampi in silicio, questi sono stati riempiti con PDMS (Sylgard-184). Lo strato di controllo è stato realizzato con un rapporto di miscelazione di 7:1 (base:agente indurente). La membrana del canale di flusso è stata ottenuta mediante rivestimento a rotazione con PDMS, con un rapporto di miscelazione di 20:1, sullo stampo in silicio dello strato di flusso. È importante sottolineare che la membrana in PDMS entra in contatto con il fondo del canale di flusso a 30, 25 e 20 psi per dispositivi con velocità di rivestimento per rotazione del PDMS rispettivamente di 1000, 1200 e 1600 giri/min. Dopo che il substrato di controllo in PDMS è stato tagliato a cubetti e forato, sia il substrato di controllo in PDMS tagliato a cubetti sia la membrana dello strato di flusso in PDMS sullo stampo in silicio sono stati inseriti in un incisore al plasma di ossigeno. Il substrato dello strato di controllo in PDMS tagliato è stato quindi accuratamente allineato e incollato alla membrana dello strato di flusso in PDMS utilizzando una piattaforma di allineamento personalizzata su un microscopio ottico. Una sottile membrana in PDMS separa il canale microfluidico dagli strati di controllo, che svolgono due funzioni diverse e sono controllati in modo indipendente. Per dirigere il flusso verso le camere di intrappolamento, un gruppo di valvole a comando pneumatico situato sopra il canale microfluidico blocca il flusso nel canale microfluidico principale quando il gruppo di valvole viene azionato. Un secondo gruppo di valvole di controllo, situato direttamente sopra le camere di intrappolamento, esercita una compressione sulla doppia emulsione intrappolata quando viene azionato. Poiché i due gruppi di valvole di controllo possono essere gestiti in modo indipendente, l’intrappolamento è disaccoppiato dalla compressione. Infine, il substrato in PDMS è stato incollato a questo vetrino.
Il dispositivo microfluidico a capillari di vetro è stato realizzato assemblando un capillare rotondo affusolato, un capillare quadrato e aghi da siringa utilizzando resina epossidica a presa rapida (5 minuti). Innanzitutto, il capillare rotondo di vetro è stato tirato utilizzando un tiracapillari. Il capillare affusolato è stato poi levigato con carta abrasiva di grana 1200 per ottenere un'apertura di 100 μm per il tubo di raccolta. La superficie esterna di un tubo di iniezione pulito con apertura di 15 μm, tirato e levigato in modo analogo, è stata trattata con triclor(1H,1H,2H,2H-perfluoroottil)silano per renderla idrofobica. Successivamente, il tubo di iniezione e il tubo di raccolta sono stati inseriti in un capillare quadrato posizionato su un vetrino e sono stati allineati al microscopio ottico. Gli aghi delle siringhe sono stati tagliati e incollati al vetrino utilizzando resina epossidica a presa rapida (5 minuti). Infine, i microtubi sono stati collegati agli aghi delle siringhe.
Intrappolamento delle doppie emulsioni
Le doppie emulsioni sono state intrappolate all’interno del dispositivo microfluidico per l’applicazione di forze meccaniche. Le doppie emulsioni con un diametro compreso tra 40 μm e 90 μm sono state innanzitutto generate in un dispositivo microfluidico a capillare di vetro e successivamente reiniettate nel dispositivo microfluidico con una diluizione di 10 volte. Per intrappolare le doppie emulsioni nelle camere di intrappolamento, il gruppo valvole di controllo 1 è stato quindi pressurizzato a 10–15 psi per bloccare il canale microfluidico principale, aumentando così la resistenza al flusso in quest’ultimo. Il rapporto di resistenza al flusso tra i microcanali e il canale microfluidico principale si ridurrà e un maggior numero di linee di flusso passerà attraverso i microcanali.
Ciò aumenta notevolmente l'efficienza di intrappolamento delle doppie emulsioni ed è possibile osservare che tutte e 14 le camere di intrappolamento si riempiano nel giro di un minuto. Una doppia emulsione verrà intrappolata se il suo raggio è inferiore alla larghezza critica istantanea del flusso, che è determinata dal rapporto di resistenza al flusso tra la micropipetta e il canale microfluidico principale.
