Ognuna di queste tecniche presenta vantaggi e svantaggi, e la scelta dipenderà dall'applicazione microfluidica specifica. In ultima analisi, una misurazione accurata dello stress di taglio può aiutare i ricercatori a comprendere meglio il comportamento cellulare in condizioni di flusso.
Qual è la definizione di stress di taglio?
Lo stress di taglio è definito come la sollecitazione generata quando una forza tangenziale agisce su una superficie. Nell'ambito della biologia e della microfluidica, la definizione di stress di taglio corrisponde alla forza d'attrito esercitata dal flusso di un fluido biologico su cellule o tessuti.Come determinare lo stress di taglio?
Lo stress di taglio nei fluidi aumenta in proporzione alla velocità e alla viscosità del fluido stesso; di conseguenza, per i fluidi newtoniani esso può essere calcolato in base alla legge di Newton tramite la seguente relazione^{1}:\tau =\eta \frac{\partial v}{\partial z}
dove \eta è la viscosità (g/cm-s = Poise)\frac{\partial v}{\partial z} è il gradiente di velocità o tasso di deformazione (shear rate) (s^{-1}), Nel sistema SI, l'unità di misura è il Pascal (Pa), mentre nel sistema cardiovascolare viene spesso impiegata un'altra unità: dyn/cm² (1 Pa = 10 dyn/cm²).
La velocità del fluido non è la stessa in ogni punto del canale, creando una distribuzione di velocità con un profilo che tende a essere parabolico nella maggior parte dei casi semplici di flusso laminare. La velocità del fluido è massima al centro e minima in prossimità della parete del canale. Quando z=0, lo sforzo di taglio generato dal fluido è definito "sforzo di taglio a parete" (wall shear stress) e il gradiente di velocità è solitamente chiamato "velocità di taglio a parete" (wall shear rate). L'ordine di grandezza dello sforzo di taglio a parete rappresenta di solito il valore più alto all'interno del canale. Negli esperimenti con cellule aderenti o quando si desidera evitare gli effetti deleteri dello sforzo di taglio, il valore dello sforzo di taglio a parete è solitamente quello preso in considerazione.
Quando si configura un esperimento biologico con la microfluidica, è fondamentale considerare lo sforzo di taglio. L'obiettivo finale può essere quello di evitare lo sforzo di taglio, riducendolo al valore minimo per prevenire il deterioramento o la morte cellulare, oppure di mimare lo sforzo di taglio in vivo per studiare i processi fisiologici, come l'impatto delle sollecitazioni meccaniche sulle cellule.
Per riprodurre un processo biologico, è importante comprendere ciò che accade in vivo. Numerosi articoli hanno descritto questo fenomeno e le relative conseguenze in vivo.
Sforzo di taglio in vivo
Wherever there is flow, shear stress exists. In vivo, shear stress is mostly due to the frictional force of blood flow against the vessel walls. In our body, some cells are continuously under shear stresses such as endothelial cells and kidney epithelial cells but flow patterns are not uniform in the vascular system^{2}:
- Nelle vene e nelle piccole arterie: si osservano generalmente flussi laminari e un elevato sforzo di taglio a parete
- In corrispondenza di biforcazioni e curvature: pattern di flusso perturbato e basso sforzo di taglio a parete
Le forze emodinamiche e lo stress meccanico risultante innescano numerose risposte biologiche ben identificate negli ultimi decenni. Il primo impatto osservabile è un cambiamento di morfologia, poiché le cellule si allungano nella direzione del flusso. A seguito dell'esposizione allo sforzo di taglio, si osserva inoltre una chiara riorganizzazione del citoscheletro^{3}, l'allineamento dei microtubuli e una variazione della distribuzione dell'actina.
È stato dimostrato, ad esempio, che gli sforzi di taglio alterano l'espressione genica, regolano l'attivazione delle vie di segnalazione e influenzano l'uptake del calcio, la differenziazione, la proliferazione e l'espressione proteica. All'aumentare dello sforzo di taglio, si attivano i meccanismi di proliferazione.
Inoltre, si possono osservare processi di rimodellamento vascolare con l'espansione del diametro del vaso e l'aumento dello spessore della parete^{4}. Al contrario, valori bassi di sforzo di taglio comportano una riduzione del diametro del vaso.
Il comportamento cellulare sotto sforzo di taglio è stato descritto in numerosi articoli. A seconda della linea cellulare, l'impatto può variare. Nel caso delle cellule staminali, può indurre la differenziazione, mentre per le cellule endoteliali (EC) lo sforzo di taglio ha un impatto notevole sul fenotipo e può persino portare allo sviluppo di alcune patologie.
Ad esempio, nelle regioni caratterizzate da uno sforzo di taglio oscillante, si possono verificare alterazioni patologiche nelle pareti arteriose, con un conseguente aumento del rischio di aterosclerosi^{5}. L'alterazione dello sforzo di taglio può inoltre svolgere un ruolo nella formazione di aneurismi a causa della sintesi di specie reattive dell'ossigeno (ROS), ossido nitrico (NO), fattori di crescita e metalloproteinasi.
Lo sforzo di taglio riveste un ruolo importante in diversi processi biologici a livello molecolare e clinico. Le forze meccaniche vengono percepite dalle cellule, traducendosi in una meccano-trasduzione che attiva risposte biologiche. Di seguito viene riportato un riepilogo dei diversi effetti descritti in letteratura in base al pattern di flusso e allo sforzo di taglio:
I valori medi dello sforzo di taglio nelle arterie umane in condizioni basali sono compresi tra circa 2 e 20 dyne/cm². È importante sottolineare che, anche a un valore di sforzo di taglio basso pari a 4 dyne/cm², si osservano modificazioni morfologiche in vivo. Valori decisamente superiori^{6} (da 30 a 100 dyne/cm²) si registrano in prossimità delle diramazioni arteriose e di curvature pronunciate, come l'arco aortico e le biforcazioni, mentre nelle vene si misurano solitamente valori molto più bassi, compresi tra 1 e 6 dyne/cm².
Sforzo di taglio in vitro
Nelle tradizionali colture cellulari 2D, le cellule non sono esposte a forze meccaniche quali sforzo di taglio, tensione e compressione, che influenzano lo sviluppo e la funzione degli organi.
Ad esempio, in assenza di flusso di fluido, non è possibile valutare l'interazione tra le cellule in studio e le cellule del sangue o del sistema immunitario. Si tratta di un limite considerevole degli studi basati sulle colture cellulari.
Pertanto, l'impiego di dispositivi microfluidici rappresenta una valida alternativa alle tecniche tradizionali in vitro grazie alla sua rilevanza fisiologica. La microfluidica consente di riprodurre un microambiente biomimetico 3D e, più recentemente, viene persino utilizzata per realizzare organi su chip (organs-on-a-chip) al fine di mimare organi in vitro. Sebbene queste applicazioni si avvicinino maggiormente a quanto avviene in vivo, la nuova sfida consiste nel tenere conto delle forze meccaniche, come lo sforzo di taglio.
Nei dispositivi microfluidici, lo sforzo di taglio è generato dall'iniezione del flusso di fluido. Data la ridotta dimensione dei dispositivi microfluidici, il flusso è di tipo laminare; di conseguenza, rappresenta un ottimo metodo per riprodurre i flussi presenti nelle vene e nelle piccole arterie, dove il flusso è solitamente unidirezionale e laminare^{7}. Nelle arterie di grandi dimensioni, i flussi riscontrati sono spesso pulsatili e laminari. In un esperimento microfluidico, la portata può essere variata periodicamente per simulare questo tipo di flusso.
In generale, la maggior parte dei pattern di flusso può essere replicata tramite la microfluidica, con l'unica eccezione del flusso turbolento, che si riscontra raramente nei sistemi biologici. La sperimentazione microfluidica costituisce pertanto un'ottima approssimazione in vivo^{8}. D'altro canto, lo sforzo di taglio può essere percepito anche come uno svantaggio a causa dei rispetti effetti deleteri intrinseci osservati a livelli elevati. Fortunatamente, è possibile progettare un esperimento microfluidico in modo tale da evitare che lo sforzo di taglio generi effetti indesiderati.
In entrambe le situazioni — sia nello studio di un fenomeno biologico sia quando lo sforzo di taglio è considerato un fattore limitante — è fondamentale dedicare il tempo necessario a considerare determinati parametri durante la progettazione dell'esperimento.
Microfluidica e sforzo di taglio negli esperimenti cellulari
Tra tutti gli aspetti da considerare nella progettazione di un esperimento microfluidico, il livello di sforzo di taglio a cui sono sottoposte le cellule rappresenta un fattore di primaria importanza fisiologica. All'interno dei dispositivi microfluidici, diversi parametri influenzano lo sforzo di taglio: le dimensioni e la geometria dei canali, la concentrazione cellulare, il tipo di linea cellulare, la modalità di erogazione della portata e così via. Alcuni di questi parametri verranno descritti in modo più dettagliato per comprendere come controllare e misurare lo sforzo di taglio nei dispositivi microfluidici.
Progettazione di un esperimento microfluidico
Riproduzione dello stress di taglio in vivo: valori sperimentali
Negli esperimenti in cui si ricercano condizioni statiche e biomimetiche, il valore utilizzato è compreso tra: 0,2 e 0,5 dyne/cm². Per simulare il flusso attraverso un determinato tipo di vaso sanguigno, è possibile utilizzare come riferimento i valori indicati di seguito per lo stress di taglio e i tassi di剪切 (shear rates):
Scelta delle linee cellulari
Le risposte cellulari allo stress di taglio e la loro capacità di resistere alle forze del fluido dipendono dai tipi cellulari. In alcuni studi sono stati osservati diversi tipi cellulari nelle medesime condizioni, portando alla conclusione che esiste un'ampia gamma di risposte allo stress di taglio a seconda della cellula utilizzata. Una fase della progettazione dell'esperimento consiste nello stabilire quali linee cellulari impiegare e quale portata applicare in funzione del risultato desiderato.
Progettazione dei chip
In qualsiasi sistema fluido, la capacità di prevedere lo stress di taglio è di fondamentale importanza per anticipare le conseguenze sul fenotipo cellulare^{11}. Di conseguenza, durante la progettazione di un esperimento e di un nuovo chip microfluidico, lo stress di taglio può essere calcolato o modellato.
Scelta del sistema di controllo del flusso
Nella microfluidica e negli esperimenti cellulari è cruciale ottenere un controllo del flusso preciso e regolare. Si tratta di un parametro chiave per gestire lo stress di taglio e, di conseguenza, la scelta dello strumento di controllo del flusso riveste grande importanza.
Esistono diverse opzioni, come siringhe a pompa, pompe peristaltiche, o sistemi di controllo della pressione con o senza valvole di flusso. Ciascuno di questi sistemi presenta vantaggi e svantaggi e la scelta dipenderà dall'applicazione microfluidica. La seguente panoramica approfondisce i relativi pro e contro dei metodi di controllo del flusso più diffusi.
Quando si lavora con lo stress di taglio, vi sono importanti svantaggi da evitare: tempo di risposta ridotto, oscillazioni indesiderate della portata e fluttuazioni incontrollabili. Tali svantaggi possono determinare una marcata discrepanza tra la portata calcolata/simulata e quella reale. Al fine di ottenere una portata quanto più vicina a quella desiderata, un tempo di risposta rapido e un controllo accurato del flusso, un sistema di controllo della pressione rappresenta una delle migliori soluzioni sul mercato.
Come misurare lo stress di taglio?
La valutazione dello stress di taglio in una coltura cellulare sottoposta a flusso può essere eseguita in molteplici modi. Lo stress di taglio può essere valutato mediante metodi teorici e numerici di dinamica dei fluidi. Per calcolare il flusso, e quindi lo stress di taglio, in un setup microfluidico, è necessario risolvere l'equazione di Navier-Stokes, sia in via numerica che analitica, al fine di ricavare il profilo di velocità per la geometria considerata. Nel caso di geometrie semplici, come un canale rettangolare largo o un canale tubolare, la soluzione analitica è semplice e reperibile in letteratura. Ad esempio, per un canale rettangolare di dimensioni w*h*l con h>w>>l, lo stress di taglio alla parete può essere calcolato come \tau=\frac{6\eta Q}{h²W} dove Q è la portata. Per un canale cilindrico, lo stress di taglio è pari a \tau=\frac{4\eta Q}{R^{3}}/\pi.
Tuttavia, queste semplici formule non rappresentano lo stress di taglio in geometrie complesse, per le quali risulta generalmente preferibile eseguire una simulazione computerizzata per stimare lo stress di taglio o il tasso di cisaglimento.
Questi calcoli sono estremamente utili per stimare, persino con precisione, lo stress di taglio. Tuttavia, quando si desidera conoscere lo stress di taglio in modo sperimentale nel modo più accurato possibile all'interno di un esperimento microfluidico, è possibile ricorrere a diversi metodi che consentono la misurazione locale o la stima dello stress di taglio nella regione d'interesse. Abbiamo sviluppato un strumento semplice (ma pratico) per aiutarvi a determinare la pressione approssimativa nel vostro chip.
Per le indagini sulle colture cellulari, può essere auspicabile misurare lo stress di taglio il più vicino possibile alle cellule. Esistono diversi metodi di rilevamento a tal fine.
Sensore basato su cellule
Lo stress di taglio da flusso può indurre l'attivazione di alcune vie di segnalazione^{12}. Un metodo sviluppato per misurare lo stress di taglio si avvale di sensori cellulari fluorescenti geneticamente codificati che reagiscono all'attivazione della via di segnalazione dello stress di taglio.
Cristalli liquidi
Il potenziale impiego dei cristalli liquidi come tecnica di misurazione dello stress è stato dimostrato nei dispositivi microfluidici^{13}. Questa tecnica sperimentale si basa sulle proprietà dei cristalli liquidi e sulle loro strutture molecolari chirali. Quando viene applicato uno stress di taglio, la struttura delle molecole si flette, determinando una variazione della polarizzazione o della lunghezza d'onda che può essere misurata.
Velocimetria a microparticelle
È possibile utilizzare sistemi di velocimetria a microparticelle (µ-PIV) per ottenere una lettura accurata dello stress di taglio alla parete, in grado di risolvere direttamente anche la superficie cellulare^{14}. Ciò consente di misurare il profilo di flusso per determinare lo stress di taglio. Un sistema µ-PIV è costituito da una telecamera ad alta velocità sincronizzata con un laser a doppia cavità che illumina le particelle immesse nel flusso liquido e ne monitora la posizione con elevata precisione. Tali sistemi sono estremamente potenti, ma la complessità della loro implementazione li rende inadatti a una misurazione agevole dello stress di taglio.
Velocimetria Laser Doppler
Un altro modo per misurare i profili di velocità nei flussi di liquidi in prossimità dell'interfaccia consiste nell'utilizzare lo shift Doppler della luce laser^{15}. In questo caso, viene monitorato lo shift Doppler della luce laser riflessa all'interno del flusso al fine di misurare il profilo di flusso del liquido e determinarne lo stress di taglio. L'apparecchiatura per tale misurazione è più semplice rispetto alla velocimetria d'immagine, poiché il laser non deve essere sincronizzato con una telecamera ed è sufficiente misurarne lo spostamento di frequenza; tuttavia, il processo è meno documentato e i risultati sono meno precisi.
Tuttavia, questa si conferma un'alternativa estremamente promettente per la misurazione della portata a basso costo e la valutazione dello shear stress in prossimità delle cellule.
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