Il fegato svolge un ruolo fondamentale nelle attività metaboliche, quali la regolazione dei livelli di glucosio nel sangue, la produzione di proteine plasmatiche, il metabolismo dei farmaci e la produzione di bile [1][2], e presenta una struttura complessa dal punto di vista morfologico e funzionale [3].
Data la sua importanza, negli ultimi decenni è stato oggetto di numerose ricerche volte a comprendere i meccanismi del metabolismo dei farmaci e della loro tossicità (DILI – lesione epatica indotta da farmaci), nonché delle malattie epatiche quali l’epatite, la cirrosi, la fibrosi e i tumori [4][5][6].
Breve panoramica sulla struttura dei sinusoidi epatici
La vena porta epatica (proveniente dall'intestino) e l'arteria epatica trasportano il sangue al fegato, dove viene miscelato nei capillari chiamati sinusoidi e raccolto nella vena centrale epatica, da cui viene riportato al cuore.
Il fegato è costituito da unità ripetitive, i lobuli, di forma esagonale, composti da epatociti (HC) disposti in strutture a cordoni attorno ai sinusoidi, separati da uno spazio perisinusoidale, lo spazio di Disse.
Gli epatociti sono le cellule parenchimali del fegato, coinvolte principalmente nella sintesi delle proteine e della bile e nel metabolismo epatico, mentre le principali cellule non parenchimali (NPC) sono le cellule endoteliali dei sinusoidi epatici (LSEC), le cellule di Kupffer (macrofagi) e le cellule stellate. Gli epatociti ricevono le sostanze nutritive dalle cellule sinusoidali attraverso scambi che avvengono nello spazio di Disse [2] [7][8].
Modelli in vitro di fegato ingegnerizzato
Un modello di “fegato su chip”: la sinusoide epatica artificiale
Abbiamo deciso di descrivere in questa sede il sinusoide epatico artificiale sviluppato da Lee et al., i quali hanno progettato una piattaforma microfluidica in grado di ricreare un microambiente fisiologico (condizioni di trasporto di massa) per la semina di epatociti primari [11].
Dettagli sulla progettazione dei chip
La piattaforma microfluidica era costituita da un canale per il flusso di nutrienti e farmaci e da un compartimento cellulare per la semina di epatociti disposti in modo molto fitto.
È stato infatti dimostrato che un’elevata densità di cellule primarie consente la formazione di interazioni cellula-cellula caratterizzate da una maggiore vitalità e attività metabolica.
Nel progetto del chip è stata inserita una barriera permeabile di tipo endoteliale, di forma sinusoidale e costituita da una serie di microcanali paralleli, al fine di (i) evitare elevate sollecitazioni di taglio che potrebbero risultare pericolose per le cellule endoteliali e (ii) raggruppare le cellule endoteliali nell’area cellulare.
Come si realizza un fegato su chip?
Microfabbricazione di chip
SU-8 (un fotoresist negativo) è stato modellato tramite fotolitografia su un wafer di silicio in due fasi: è stato applicato mediante rivestimento a rotazione uno strato di SU-8 dello spessore di 1 µm per creare i canali della barriera di tipo endoteliale, quindi è stato utilizzato uno strato di SU-8 dello spessore di 30 µm per creare i canali per il flusso e la semina delle cellule.
Successivamente, il polidimetilsilossano (PDMS) sono stati replicati dallo stampo in SU-8 e incollati a un vetrino.
Progettazione dei parametri del chip per riprodurre la microcircolazione epatica
Il chip è stato progettato per garantire una portata volumetrica di nutrienti pari a 100 pL/s (per circa 250 epatociti caricati nell’area cellulare), tipica della microcircolazione epatica. A tal fine, la larghezza, l’altezza e la lunghezza dei canali sono state fissate rispettivamente a (50 x 30 x 1200) µm e (2 x 1 x 30) µm per il canale di flusso e la barriera permeabile.
Utilizzando una sezione trasversale dei canali di barriera pari a 2 x 1 µm, è stato garantito un flusso convettivo ridotto, e quindi un’elevata resistenza fluidica totale (1000 volte superiore a quella del canale del fluido), consentendo così il trasporto diffusivo. In questo modo, gli HC sono stati esposti a basse sforzi di taglio e hanno potuto ricevere sostanze nutritive tramite diffusione attraverso la barriera.
Progettazione dei parametri del chip per controllare il carico degli epatociti disposti in modo compatto
Il design della barriera di tipo endoteliale ha inoltre consentito di caricare un’elevata densità di cellule staminali ematopoietiche senza danneggiare né le cellule stesse né la barriera.
È stato verificato che la sezione trasversale ristretta dei canali riduce la deformazione della membrana cellulare all’interfaccia.
Pertanto, un flusso positivo ha convogliato le cellule verso il fondo dell’area di coltura senza causare intasamenti, determinando un’elevata densità di cellule. Inoltre, l’aumento della resistenza generata dalle cellule ha determinato una diminuzione della velocità di carico al termine del processo di semina.
Chip microfluidico per la coltura di cellule primarie: risultati e conclusioni
Sia gli epatociti primari di ratto che quelli umani sono stati inseriti nell’area cellulare e la loro vitalità è stata valutata fino a 7 giorni.
La piattaforma microfluidica è stata sottoposta a perfusione continua con terreno di coltura. I risultati hanno dimostrato che entrambe le linee cellulari hanno mantenuto la loro vitalità dopo 7 giorni senza necessità di rivestimento in collagene (necessario nei sistemi di coltura statici).
Inoltre, l'elevata densità cellulare ha garantito un'elevata attività metabolica grazie ai contatti tra le cellule.
La revisione illustra come le piattaforme microfluidiche possano essere progettate per riprodurre fedelmente specifiche funzioni di un tessuto o di un organo. In questo lavoro è stato progettato un dispositivo microfluidico composto da un canale di flusso, un’area cellulare e una barriera permeabile di tipo endoteliale, al fine di ricreare le condizioni della microcircolazione epatica, migliorando la vitalità degli epatociti e le interazioni cellula-cellula.
Recensione scritta da Alessandra Dellaquila.
Riferimenti
[1] Y. B. Kang et al., “Sinusoide epatica su chip: cocultura a strati a lungo termine di epatociti primari di ratto e cellule endoteliali in piattaforme microfluidiche”, Biotechnol. Bioeng., vol. 112, n. 12, pp. 2571–2582, 2015.
[2] C. H. Beckwitt et al., “Fegato ‘organo su chip’”, Exp. Cell Res., 2017.
[3] Y. Du et al., “Riproduzione delle strutture e delle funzioni dei sinusoidi epatici mediante un chip microfluidico configurato in 3D”, Lab Chip, vol. 17, n. 5, pp. 782–794, 2017.
[4] L. A. Vernetti et al., “Una piattaforma di microfisiologia epatica umana per lo studio della fisiologia, della sicurezza dei farmaci e dei modelli patologici”, Exp. Biol. Med., vol. 241, n. 1, pp. 101–114, 2016.
[5] V. Natarajan, E. N. Harris e S. Kidambi, “SEC (cellule endoteliali sinusoidali), microambiente epatico e fibrosi”, Biomed Res. Int., vol. 2017, 2017.
[6] S. S. Bale et al., “Piattaforme in vitro per la valutazione della tossicità epatica”, Exp. Biol. Med., vol. 239, n. 9, pp. 1180–1191, 2014.
[7] A. J. Strain e J. M. Neuberger, “Un fegato bioartificiale: lo stato dell’arte”, Science (80-. ), vol. 295, n. 5557, pp. 1005–1009, 2002.
[8] C. Moraes, G. Mehta, S. C. Lesher-Perez e S. Takayama, “Organs-on-a-Chip: A Focus on Compartmentalized Microdevices”, vol. 40, 2011.
[9] H. Tsutsui e S. Nishiguchi, “Importanza delle cellule di Kupffer nello sviluppo delle lesioni epatiche acute nei topi”, vol. 15, 2014.
[10] G. H. Underhill e S. R. Khetani, “Modelli epatici bioingegnerizzati per test farmacologici e studi sulla differenziazione cellulare”, Cell. Mol. Gastroenterol. Hepatol., vol. 5, n. 3, pp. 426–439, 2018.
[11] P. J. Lee, P. J. Hung e L. P. Lee, “Una sinusoide epatica artificiale con una barriera microfluidica simile a quella endoteliale per la coltura di epatociti primari”, Biotechnol. Bioeng., vol. 97, n. 5, pp. 1340–1346, 2007.
