L'interesse per la generazione di nanoparticelle lipidiche è cresciuto nel corso dell'ultimo decennio. In effetti, questi nanoliposomi presentano numerosi vantaggi, come la possibilità di combinare diverse sostanze terapeutiche, proteggere i principi attivi dalle alterazioni, controllare la diffusione delle sostanze nell'organismo o persino consentire la sterilizzazione completa mediante filtrazione.
Cos'è un nanoliposoma?
I nanoliposomi o nanoparticelle lipidiche sono spesso costituiti da uno o più strati lamellari. Tali strati comprendono un doppio strato fosfolipidico che racchiude un piccolo volume di liquido acquoso. Il diametro dei nanoliposomi può variare da poche decine di nanometri a centinaia di micrometri a seconda del metodo utilizzato per produrli.
Fosfolipidi e lipidi costituiscono i componenti principali delle membrane liposomiali. Essi presentano la particolarità di essere solubili in vari solventi organici ed è precisamente per questa proprietà che la maggior parte dei metodi attuali impiega solventi organici per solubilizzare i lipidi come prima fase del protocollo.
L'ascesa della microfluidica apre nuove prospettive per la preparazione di nanoparticelle a base lipidica. I metodi microfluidici hanno dimostrato la loro capacità di controllare il processo di miscelazione delle fasi organica e acquosa, nonché le dimensioni, ottenendo così un'elevata monodispersione e offrendo la possibilità di sfruttare il design del chip microfluidico per variare la composizione e la dimensione dei nanoliposomi ottenuti.
Vantaggi dell'utilizzo della microfluidica per la generazione di nanoliposomi
I metodi più antichi e tradizionali per la preparazione di liposomi consistono nelle cosiddette tecniche su macroscala o a lotti, basate sulla disidratazione iniziale di film lipidici seguita dal processo di swell e dalla manipolazione meccanica finale per creare i doppi strati dispersi in acqua. Tuttavia, questi metodi sono caratterizzati da scarsa riproducibilità, controllo di processo limitato e uso inefficiente di materiali e reagenti.
La microfluidica è stata recentemente studiata come metodo efficiente per la preparazione di liposomi in modo controllato, riproducibile e ad elevata produttività (high-throughput).
La microfluidica consente di ridurre i volumi utilizzati e i costi associati gestendo i fluidi in compartimenti geometricamente vincolati, tipicamente caratterizzati da scale di lunghezza micrometriche e bassi numeri di Reynolds.
Quali dispositivi microfluidici utilizzare per la preparazione di nanoliposomi?
Alcuni chip possono anche presentare un trattamento specifico, che influenzerà le dimensioni o la composizione dei nanoliposomi. In questa sezione esamineremo quindi le diverse geometrie esistenti e alcuni esempi tratti dalla letteratura per valutarne le relative applicazioni.
Mescolatore a spina di pesce (Herringbone) per la produzione di nanoparticelle lipidiche
Recentemente, la micromiscelazione tramite il metodo Herringbone è stata studiata e mostra notevoli vantaggi rispetto ad altri metodi di preparazione in termini di efficienza di produzione dei liposomi.
Ad esempio, i liposomi pEGilati sono stati preparati con successo utilizzando un mescolatore Herringbone. Questo dispositivo è un miscelatore ad avvezione caotica in grado di perturbare il flusso laminare tipico dei microcanali e di ridurre il tempo necessario per il processo di preparazione dei liposomi.
Il pattern specifico del dispositivo, costituito da scanalature a spina di pesce, ridistribuisce i fluidi creando un flusso trasversale nel microcanale. I vertici delle scanalature sono sfasati di circa un terzo della larghezza del canale e le scanalature stesse generano due vortici contro-rotanti. Il successivo set di scanalature Herringbone con orientamento speculare dei vortici consente di completare un ciclo di miscelazione completo, come mostrato in Fig. 2.
The alternation of these herringbone sets reorients the flow periodically and strongly improves the mixing. This microfluidic preparation method allows the controlled creation of liposomes of different sizes (∼100 nm) and good dispersity (< 0.2). By changing the flow rate parameters and the formulations in terms of aqueous buffer, phospholipid concentrations and composition it is possible to finely tune the production of liposomes with the desired features.
A illustrare questo design è il team di Leung et al. (2015), che propone un metodo generale per l'incapsulamento di macromolecole (siRNA) in un sistema di nanoparticelle lipidiche. Utilizzando un micromiscelatore Herringbone, i ricercatori sono stati in grado di generare nanoparticelle con un diametro compreso tra 40 e 140 nm.
Esistono molteplici tecniche e, di conseguenza, svariate geometrie che consentono di generare nanoparticelle. Le informazioni qui presentate vi aiuteranno a scegliere il dispositivo microfluidico più adatto alle vostre applicazioni e alle dimensioni delle nanoparticelle che desiderate generare.
Generatore di goccioline per la produzione di nanoparticelle lipidiche
Tipicamente, tre flussi convergono nello stesso microcanale, come mostrato in Fig. 3. Questa è la configurazione tipica dei dispositivi microfluidici adatti alla generazione di goccioline. Come si può notare, una soluzione alcolica di fosfolipidi viene iniettata in un canale centrale affiancato da due soluzioni acquose laterali.
Il flusso contenente i lipidi viene focalizzato grazie a:
- Il basso numero di Reynolds.
- La diffusione dominata dal trasporto di massa.
L'alcol diffonde nella soluzione acquosa e la sua concentrazione nel flusso centrale inizia a diminuire. Quando raggiunge una concentrazione critica al di sotto della solubilità dei fosfolipidi, questi ultimi si organizzano spontaneamente in liposomi mediante un processo di auto-assemblaggio.
Il rapporto tra le portate volumetriche della fase lipidica e di quella acquosa, insieme alla portata totale, influenza le dimensioni dei liposomi ottenuti e la loro regolazione consente una preparazione controllata.
Infine, Karnik e collaboratori hanno dimostrato nel 2008 che è possibile generare nanoparticelle tramite focalizzazione di flusso con un grado di monodispersione molto elevato. Il team è infatti in grado di produrre nanoparticelle di 31 nm di diametro (± 1 nm). In questo caso, le dimensioni variano in funzione della composizione delle nanoparticelle.
Il dispositivo microfluidico a Y per la produzione di nanoparticelle lipidiche
Questo design consente di mettere in contatto due fluidi (generalmente una soluzione acquosa contenente tensioattivo e una soluzione lipidica accoppiata a un solvente) e di avviare la nanoprecipitazione nel canale di raccolta. La nanoprecipitazione consiste nell'aggregazione di nanoparticelle nello spazio e nel tempo.
Il team di Roces et al. (2020) ha utilizzato un micromiscelatore a Y per sviluppare nanoparticelle lipidiche. Questo dispositivo è stato impiegato per generare nanoparticelle con un diametro compreso tra 100 e 200 nm. Le dimensioni di queste nanoparticelle vengono notevolmente ridotte dopo la filtrazione, consentendo di ottenere nanolipidi compresi tra 50 e 80 nm con un indice di polidispersione pari a 0,2.
Il dispositivo capillare coassiale 3D per la produzione di nanoparticellelipidiche
Questi dispositivi offrono la possibilità di generare flussi coassiali tridimensionali, essenziali per un trasferimento di massa rapido e uniforme. Il dispositivo microfluidico capillare co-corrente è costituito da due capillari. Un capillare in vetro rastremato è stato inserito all'interno di un altro capillare cilindrico più grande con un allineamento coassiale. Il fluido interno (soluzione acquosa contenente tensioattivo) scorre all'interno del capillare cilindrico interno, mentre il fluido esterno (una soluzione lipidica associata a un solvente) fluisce tra il capillare cilindrico interno e quello esterno.
Con questo dispositivo microfluidico, Liu et al. hanno pubblicato nel 2015 un articolo che evidenzia la generazione di nanoparticelle lipidiche con un diametro compreso tra 70 e 280 nm e un indice di polidispersidadicità vicino a 0,1. Questa dimensione evolve in funzione del numero di Reynolds a causa della presenza dei capillari.
Considerazioni finali
Esistono numerose tecniche e, di conseguenza, molteplici geometrie che consentono di generare nanoparticelle. Le informazioni qui presentate vi aiuteranno a scegliere il dispositivo microfluidico più adatto alle vostre applicazioni e alle dimensioni delle nanoparticelle che desiderate produrre.
Darwin Microfluidics sostiene attivamente questa rivoluzione. Forniamo dispositivi microfluidici innovativi per la preparazione di liposomi e il nostro team di scienziati esperti e PhDs offre il supporto necessario affinché i ricercatori possano raggiungere il successo nelle loro attività.
🧠 Punti chiave da ricordare
- I liposomi o le nanoparticelle lipidiche sono vescicole racchiuse ampiamente utilizzate per l'incapsulamento di diverse tipologie di molecole, come DNA, proteine, farmaci e/o altri composti chimici.
- I metodi microfluidici offrono un approccio alternativo per la preparazione di nanoparticelle lipidiche, garantendo un controllo superiore su dimensioni e composizione.
- I rapporti di portata tra i flussi della fase lipidica e di quella acquosa, insieme alla portata totale, possono essere regolati per ottenere liposomi delle dimensioni desiderate.
- By adjusting parameters such as the flow rate and formulation components, it is possible to achieve precise control over the size (<100 nm) and dispersity (< 0.2) of the liposomes.
