Per definizione, un liposoma è costituito da un doppio strato lipidico che incapsula una fase acquosa. I liposomi sono sempre più utilizzati per veicolare farmaci in modo mirato e con dimensioni controllate. È qui che entra in gioco la microfluidica. La scienza dei sistemi di manipolazione dei fluidi viene infatti impiegata per il controllo estremamente preciso di volumi molto ridotti, un aspetto particolarmente idoneo alla generazione di liposomi di dimensioni micro- e nanometriche. In questa application note confronteremo i dati di letteratura con i risultati ottenuti utilizzando due design di chip microfluidici per la generazione di nanoliposomi: il micromiscelatore a spina di pesce (herringbone) e la focalizzazione del flusso idrodinamico. Questi chip microfluidici sono stati sottoposti a un trattamento superficiale idrofilo. Per generare i nanoliposomi abbiamo scelto di utilizzare PLGA (acido poli(lattico-co-glicolico)) solubilizzato in acetonitrile. La fase acquosa è costituita da acqua e tensioattivo (PVA all'1%).
Micromiscelatore a spina di pesce
Il chip micromiscelatore a spina di pesce (herringbone) è una soluzione all-in-one che consente di miscelare due fluidi all'interno di un canale microfluidico in modo semplice ed efficiente. Questo strumento è adatto a numerose applicazioni, quali immunodosaggi o miscele di prodotti per PCR, oltre che alla generazione di nanoliposomi. Questo tipo di chip può essere realizzato in vari materiali, tra cui PDMS, vetro e termoplastiche (PC, COC, COP, ecc.).
Con questo metodo è possibile generare nanoliposomi con dimensioni comprese tra 100 e 200 nm, secondo quanto riportato da Roces et al. 2020, Pharmaceutics.
Nella pratica, abbiamo generato nanoliposomi utilizzando un chip micromiscelatore a spina di pesce in policarbonato (microfluidic ChipShop, 10000019). I risultati indicano che abbiamo ottenuto nanoliposomi con una dimensione media di 247 nm ± 78,8 nm. Le misurazioni sono state eseguite mediante diffusione dinamica della luce (DLS) utilizzando lo strumento Zetasizer Nano ZS su 11 campioni con rapporti di portata compresi tra 1 e 15.
Figura 2: Misurazione dei diametri dei nanoliposomi generati da un dispositivo staggered herringbone mixer (microfluidic ChipShop, 10000019). L'acronimo "FRR" indica il rapporto di portata (flow rate ratio): corrisponde al rapporto tra il flusso della fase continua e il flusso della fase dispersa. Misurazioni eseguite da Christelle Angély su uno Zetasizer Nano ZS (Malvern Panalytical) presso la piattaforma di biochimica e biofisica dell'Istituto di Psichiatria e Neuroscienze di Parigi.
Focalizzazione del flusso idrodinamico
Il dispositivo microfluidico di focalizzazione del flusso idrodinamico consente la miscelazione precisa dei reagenti con tempi di miscelazione brevi in condizioni di flusso laminare, il che permette di generare, ad esempio, nanoparticelle monodisperse di dimensioni regolabili.
Utilizzando questa tecnica di focalizzazione del flusso, è possibile generare nanoliposomi con dimensioni >150 nm e generalmente intorno ai 200 nm. Tuttavia, a seconda della composizione dei nanoliposomi, le loro dimensioni possono variare notevolmente, come dimostrato nel lavoro di Karnik et al. pubblicato nel 2008. Il team è infatti in grado di produrre nanoparticelle di 31 nm di diametro (± 1 nm) con un elevato grado di monodispersione.
Nel nostro caso, siamo stati in grado di generare nanoliposomi con una dimensione media di 250,9 nm ± 66,8 nm utilizzando un chip a focalizzazione di flusso in policarbonato (microfluidic ChipShop, 10000004). Le misurazioni sono state eseguite mediante diffusione della luce dinamica (DLS) utilizzando lo strumento Zetasizer Nano ZS su 11 campioni con rapporti di portata compresi tra 1 e 15.
Figura 4: Misurazione dei diametri dei nanoliposomi generati da un dispositivo a focalizzazione di flusso (microfluidic ChipShop, 10000004). "FRR" indica il rapporto di portata (flow rate ratio): corrisponde al rapporto tra il flusso della fase continua e il flusso della fase dispersa. Misurazioni eseguite da Christelle Angély su uno Zetasizer Nano ZS (Malvern Panalytical) presso la piattaforma di biochimica e biofisica dell'Istituto di Psichiatria e Neuroscienze di Parigi.
In conclusione, i due metodi qui presentati sono stati in grado di generare nanoliposomi di dimensioni simili, ovvero circa 250 nm di diametro, indipendentemente dal rapporto di portata. La scelta della composizione del nanoliposoma, che si tratti della selezione del lipide, del solvente o della fase acquosa, deve pertanto essere presa in considerazione. Inoltre, diverse tecniche ben documentate sono efficaci nel ridurre le dimensioni dei nanoliposomi generati. Ad esempio, è possibile sottoporre il campione a sonicazione (da 1 a 5 min) per ridurne le dimensioni fino al 50%. Molteplici pubblicazioni descrivono la filtrazione e/o la dialisi come metodi molto efficienti per purificare i nanoliposomi e ridurne conseguentemente le dimensioni (da 50 a 80 nm).
