Cada una de estas técnicas tiene sus ventajas y desventajas, y la elección dependerá de la aplicación microfluídica. En última instancia, medir con precisión la tensión de cizallamiento puede ayudar a los científicos a comprender mejor el comportamiento de las células en condiciones de flujo.
¿Cuál es la definición de «tensión de cizallamiento»?
La tensión de cizallamiento se define como la tensión que se genera cuando una fuerza tangencial actúa sobre una superficie. La definición de tensión de cizallamiento aplicada a la biología y la microfluídica es la fuerza de fricción de un flujo de fluido biológico que actúa sobre células o tejidos.¿Cómo se determina la tensión de cizallamiento?
La tensión de cizallamiento del fluido aumenta con la velocidad y la viscosidad del fluido; por lo tanto, en el caso de los fluidos newtonianos, puede calcularse según la ley de Newton mediante la siguiente relación:^{1}:\tau = \eta \frac{\partial v}{\partial z}
donde \eta La viscosidad es la viscosidad (g/cm·s = poise)\frac{\partial v}{\partial z} es el gradiente de velocidad o la velocidad de cizallamiento (s^{-1}), En el sistema internacional (SI), la unidad es el pascal (Pa), pero en el sistema cardiovascular se suele utilizar otra unidad: dyn/cm² (1 Pa = 10 dyn/cm²).
El flujo del fluido no tiene la misma velocidad en todos los puntos del canal, lo que da lugar a una distribución de la velocidad con un perfil que tiende a ser parabólico en la mayoría de los casos sencillos de flujo laminar. La velocidad del fluido es mayor en el centro y menor cerca de la pared del canal. Cuando z = 0, la tensión de cizallamiento generada por el fluido se denomina «tensión de cizallamiento en la pared» y el gradiente de velocidad suele denominarse «tasa de cizallamiento en la pared». El orden de magnitud de la tensión de cizallamiento en la pared suele ser el valor más alto del canal. Cuando se realizan experimentos con células adherentes o se desea evitar los efectos perjudiciales de la tensión de cizallamiento, se suele utilizar el valor de la tensión de cizallamiento en la pared.
A la hora de diseñar un experimento de biología con microfluídica, es fundamental tener en cuenta la tensión de cizallamiento. El objetivo final puede ser, por un lado, evitar la tensión de cizallamiento y reducirla a su valor mínimo para evitar el deterioro de las células e incluso su muerte; o, por otro lado, imitar la tensión de cizallamiento in vivo para estudiar procesos fisiológicos, como el impacto de las tensiones mecánicas en las células.
Para reproducir un proceso biológico, es importante saber qué ocurre in vivo. Son numerosos los artículos que han descrito este fenómeno y sus consecuencias in vivo.
Esfuerzo de cizallamiento in vivo
Wherever there is flow, shear stress exists. In vivo, shear stress is mostly due to the frictional force of blood flow against the vessel walls. In our body, some cells are continuously under shear stresses such as endothelial cells and kidney epithelial cells but flow patterns are not uniform in the vascular system^{2}:
- En las venas y las arterias pequeñas: por lo general, el flujo es laminar y se observa principalmente una elevada tensión de cizallamiento en la pared.
- En ramificaciones y curvas: patrón de flujo alterado y baja tensión de cizallamiento en la pared
Las fuerzas hemodinámicas y la tensión mecánica resultante provocan numerosas respuestas biológicas que se han identificado claramente a lo largo de las últimas décadas. El primer efecto observable es un cambio morfológico, ya que las células se alargan en la dirección del flujo. Tras la exposición a la tensión de cizallamiento, también se produce una clara reorganización del citoesqueleto^{3}, la alineación de los microtúbulos y un cambio en la distribución de la actina.
Por ejemplo, se ha demostrado que las tensiones de cizallamiento alteran la expresión génica, regulan la activación de las vías de señalización y tienen cierta influencia en la captación de calcio, la diferenciación, la proliferación y la expresión proteica. Cuando aumentan las tensiones de cizallamiento, se activan los mecanismos de proliferación.
Además, se pueden observar procesos de remodelación vascular que se caracterizan por una expansión del diámetro del vaso y un aumento del grosor de la pared^{4}. Por el contrario, unos valores bajos de esfuerzo de cizallamiento provocarán una reducción del diámetro del vaso.
El comportamiento celular bajo tensión de cizallamiento se ha descrito en numerosos artículos. Dependiendo de la línea celular, el efecto puede variar.En el caso de las células madre, puede inducir la diferenciación, mientras que en las células endoteliales (CE), la tensión de cizallamiento tiene un enorme impacto en el fenotipo y puede incluso dar lugar a algunas patologías.
Por ejemplo, en regiones con tensión de cizallamiento oscilante, esto puede provocar cambios patológicos en las paredes arteriales y aumenta el riesgo de aterosclerosis^{5}. La alteración de la tensión de cizallamiento también puede influir en la aparición de aneurismas debido a la síntesis de especies reactivas de oxígeno (ROS), óxido nítrico (NO), factores de crecimiento y metaloproteinasas.
La tensión de cizallamiento desempeña un papel importante en diversos procesos biológicos, tanto a nivel molecular como clínico. Las células detectan las fuerzas mecánicas, lo que da lugar a la mecanotransducción y, a su vez, a respuestas biológicas. A continuación, se ofrece un resumen de los diferentes efectos descritos en la bibliografía en función del patrón de flujo y de la tensión de cizallamiento:
Los valores medios de la tensión de cizallamiento en las arterias humanas en condiciones basales oscilan entre 2 y 20 dinas/cm². Es importante señalar que, incluso con una tensión de cizallamiento tan baja como 4 dinas/cm², se observan cambios morfológicos in vivo. Se pueden observar valores mucho más elevados^{6} (de 30 a 100 dinas/cm²) cerca de las ramificaciones arteriales y en zonas de fuerte curvatura, como el arco aórtico o las bifurcaciones, mientras que en las venas suelen medirse valores mucho más bajos, de 1 a 6 dinas/cm².
Esfuerzo de cizallamiento in vitro
En los cultivos celulares bidimensionales convencionales, las células no están expuestas a fuerzas mecánicas como la tensión de cizallamiento, la tensión y la compresión, que influyen en el desarrollo y el funcionamiento de los órganos.
Por ejemplo, cuando no hay flujo de líquido, no es posible evaluar la interacción entre las células estudiadas y las células sanguíneas e inmunitarias. Se trata de una limitación enorme de los estudios de cultivo celular.
Por lo tanto, el uso de dispositivos microfluídicos constituye una alternativa viable a las técnicas in vitro tradicionales debido a su relevancia fisiológica. La microfluídica puede proporcionar un microentorno biomimético tridimensional y, más recientemente, se utiliza incluso para crear «órganos en un chip» con el fin de imitar los órganos in vitro. Estas aplicaciones se acercan más a lo que ocurre in vivo, pero el nuevo reto consiste en tener en cuenta las fuerzas mecánicas, como la tensión de cizallamiento.
En los dispositivos microfluídicos, la tensión de cizallamiento se genera mediante la inyección del flujo de fluido. Debido a las reducidas dimensiones de los dispositivos microfluídicos, el flujo es laminar; por lo tanto, es una buena forma de imitar los flujos que se dan en las venas y las arterias pequeñas, donde el flujo suele ser unidireccional y laminar^{7}. En las arterias más grandes, los flujos que se observan suelen ser pulsátiles y laminares. En un experimento microfluídico, el caudal puede modificarse periódicamente para imitar este tipo de flujo.
En general, la mayoría de los patrones de flujo pueden reproducirse mediante microfluídica; la única excepción es el flujo turbulento, que rara vez se da en los sistemas biológicos. Por lo tanto, la experimentación microfluídica constituye una buena aproximación in vivo^{8}. Por otra parte, la tensión de cizallamiento también puede considerarse un inconveniente debido a los efectos perjudiciales inherentes que se observan a niveles elevados. Afortunadamente, es posible diseñar un experimento microfluídico de tal forma que el esfuerzo cortante no tenga efectos indeseados.
Tanto en el caso del estudio de un fenómeno biológico como cuando la tensión de cizallamiento se considera un factor limitante, es fundamental dedicar tiempo y tener en cuenta ciertos parámetros a la hora de diseñar el experimento.
Microfluídica y tensión de cizallamiento en experimentos con células
Entre todos los aspectos que hay que tener en cuenta a la hora de diseñar un experimento de microfluídica, el nivel de esfuerzo de cizallamiento al que se ven sometidas las células es una cuestión de gran importancia fisiológica. En los dispositivos microfluídicos, hay varios parámetros que influyen en la tensión de cizallamiento: las dimensiones y la geometría de los canales, la concentración celular, el tipo de línea celular, la forma en que se aplica el caudal, etc. Se describirán con más detalle algunos de los parámetros mencionados para comprender cómo controlar y medir la tensión de cizallamiento en los dispositivos microfluídicos.
Diseño de un experimento de microfluídica
Simulación de la tensión de cizallamiento in vivo: valores experimentales
En los experimentos en los que se desean condiciones estáticas y biomiméticas, el valor utilizado oscila entre 0,2 y 0,5 dinas/cm². Para simular el flujo a través de un determinado tipo de vaso, pueden utilizarse como referencia los valores de tensiones de cizallamiento y velocidades de cizallamiento que se indican a continuación:
Elección de las líneas celulares
Las respuestas celulares a la tensión de cizallamiento y su capacidad para resistir las fuerzas de los fluidos dependen del tipo de célula. En algunos estudios se han observado diferentes tipos de células en las mismas condiciones, lo que ha llevado a la conclusión de que existe una amplia variedad de respuestas a la tensión de cizallamiento en función del tipo de célula utilizada. Uno de los pasos del experimento de diseño consiste en determinar qué líneas celulares deben utilizarse y qué caudal debe aplicarse en función del resultado deseado.
Diseño de circuitos integrados
En cualquier sistema de fluidos, la capacidad de predecir la tensión de cizallamiento reviste una gran importancia para predecir las consecuencias sobre el fenotipo de las células^{11}. Por lo tanto, a la hora de diseñar un experimento y un nuevo chip microfluídico, es posible calcular o modelar la tensión de cizallamiento.
Elección del sistema de control de caudal
En microfluídica y en experimentos con células, es fundamental lograr un control preciso y uniforme del flujo. Se trata de un parámetro clave para controlar la tensión de cizallamiento y, por lo tanto, la elección del instrumento de control del flujo es importante.
Existen varias opciones, como bombas de jeringa, bombas peristálticas, o sistemas de control de presión con o sin interruptores de caudal. Cada uno de estos sistemas tiene sus ventajas e inconvenientes, y la elección dependerá de la aplicación microfluídica. A continuación se ofrece una análisis profundiza en las ventajas y desventajas relativas de los métodos de control de caudal más habituales.
A la hora de gestionar la tensión de cizallamiento, hay que evitar algunos inconvenientes importantes: un tiempo de respuesta lento, oscilaciones indeseadas en el caudal y fluctuaciones incontrolables. Estos inconvenientes pueden dar lugar a una diferencia considerable entre el caudal calculado o simulado y el real. Para conseguir un caudal lo más cercano posible al deseado, un tiempo de respuesta rápido y un control preciso del caudal, un sistema de control de presión puede ser una de las mejores soluciones del mercado.
¿Cómo se mide la tensión de cizallamiento?
La evaluación de la tensión de cizallamiento en un cultivo celular sometido a un flujo puede realizarse de diversas formas. La tensión de cizallamiento puede evaluarse utilizando métodos teóricos y numéricos de dinámica de fluidos. Para calcular el flujo —y, por tanto, la tensión de cizallamiento— en un sistema microfluídico, es necesario resolver la ecuación de Navier-Stokes, ya sea numérica o analíticamente, con el fin de determinar el perfil de velocidad para la geometría considerada. En el caso de geometrías sencillas, como un canal rectangular ancho o un canal tubular, la solución analítica es sencilla y puede consultarse en la bibliografía especializada. Por ejemplo, para un canal rectangular de dimensiones w*h*l con h>w>>l, la tensión de cizallamiento en la pared puede calcularse como \tau=\frac{6\eta Q}{h²W}, siendo Q el caudal. Para un canal cilíndrico, la tensión de cizallamiento es \tau=\frac{4\eta Q}{R^{3}}/\pi.
Sin embargo, estas fórmulas sencillas no reflejan la tensión de cizallamiento en geometrías complejas, en las que suele ser preferible realizar una simulación por ordenador para estimar la tensión de cizallamiento o la velocidad de cizallamiento.
Estos cálculos resultan muy útiles para estimar, incluso con precisión, la tensión de cizallamiento. Sin embargo, cuando se desea conocer la tensión de cizallamiento de la forma más precisa posible en un experimento microfluídico, se pueden emplear varios métodos que permiten medir o estimar localmente la tensión de cizallamiento en la zona de interés. Hemos desarrollado una herramienta sencilla (pero práctica) herramienta para ayudarte a determinar la presión aproximada en tu chip.
Para la investigación con cultivos celulares, puede ser conveniente medir la tensión de cizallamiento lo más cerca posible de las células. Existen varios métodos de detección para hacerlo.
Sensor basado en células
Las señales de tensión de cizallamiento por flujo pueden dar lugar a la activación de alguna vía de señalización^{12}. Un método que se ha desarrollado para medir la tensión de cizallamiento consiste en sensores celulares fluorescentes codificados genéticamente que reaccionan ante la activación de la vía de señalización por tensión de cizallamiento por flujo.
Cristal líquido
Se ha demostrado el potencial uso de los cristales líquidos como técnica de medición del esfuerzo cortante en dispositivos microfluídicos^{13}. Esta técnica experimental se basa en las propiedades de los cristales líquidos y en sus estructuras moleculares quirales. Cuando se aplica un esfuerzo cortante, la estructura de las moléculas se deforma, lo que puede provocar un cambio en la polarización o en la longitud de onda que es posible medir.
Velocimetría de micropartículas
Los sistemas de velocimetría de micropartículas (µ-PIV) pueden utilizarse para obtener una lectura precisa de la tensión de cizallamiento en la pared, que además permite visualizar directamente la superficie de las células^{14}. Esto permite medir el perfil del flujo para determinar la tensión de cizallamiento. Un sistema µ-PIV consta de una cámara de alta velocidad sincronizada con un láser de doble cavidad que ilumina las partículas introducidas en el flujo de líquido y supervisa su posición con gran precisión. Estos sistemas son realmente potentes, pero la complejidad de su implementación los hace poco adecuados para una medición sencilla de la tensión de cizallamiento.
Velocimetría Doppler láser
Otra forma de medir los perfiles de velocidad en flujos de líquido cerca de la interfaz consiste en utilizar el desplazamiento Doppler de la luz láser^{15}. En este caso, se monitoriza el desplazamiento Doppler de la luz láser reflejada en el interior del flujo con el fin de medir el perfil de flujo del líquido y determinar la tensión de cizallamiento. El aparato para realizar dicha medición es más sencillo que el de la velocimetría por imagen, ya que no es necesario sincronizar el láser con una cámara y basta con medir su desplazamiento de frecuencia; sin embargo, el proceso está menos documentado y los resultados no son tan precisos.
No obstante, se trata de una alternativa realmente prometedora para la medición del caudal a bajo coste y la evaluación de la tensión de cizallamiento más cerca de las células.
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