In diesem Tutorial beschreiben wir anhand des Beispiels eines Doppelemulsions- und trapping-Chips alle Schritte zur Herstellung eines mikrofluidischen Chips. Dieses Protokoll, das auf den Artikeln von Ho, Lee und Liu (veröffentlicht 2016 in Scientific Reports) sowie von Kole et al. (veröffentlicht 2015 im J. Res. Natl. Inst. Stand. Technology) basiert, liefert Ihnen alle Werkzeuge vom Design bis zur Mikrofazilitierung, um Ihr eigenes Gerät zu bauen.
Design eines Chips
Das nachfolgend vorgestellte Design wurde für die Generierung von Doppelemulsionströpfchen entwickelt.
Nachfolgend finden Sie ein detailliertes Protokoll (aus dem Artikel von Kole et al., veröffentlicht 2015 im J. Res. Natl. Inst.), das Ihnen die Entwurfsphase eines mikrofluidischen Chips erleichtert:
1. Zunächst ist es erforderlich, eine CAD-Software (Computer-Aided Design) für den Entwurf des mikrofluidischen Chips zu verwenden.
2. Als Nächstes empfehlen wir die Verwendung des Umrisses eines 100-mm-Wafers (dies hängt natürlich von den Abmessungen Ihres Chips ab) mit einem Standard-Flat als äußerer Begrenzung des Wafer-Arrays, wobei die Strukturelemente im zentralen Bereich von etwa 90 mm des Wafers platziert werden sollten, um mögliche Randfehler zu vermeiden.
3. Für die Herstellung eines Chips mit mehreren Lithographieebenen, die das Aufbringen von Photoresist auf strukturierte Elemente sowie die Ausrichtung nachfolgender Lithographieebenen erfordern, empfehlen wir folgende Vorgehensweise:
3.1. Sie können die Strukturelemente des Chips, wie etwa die unteren Ausrichtungsmarken des Substrats, auf der ersten Designebene platzieren. Diese Reihenfolge ist optimal, um Elemente mit vertikalen Nanometerabmessungen in einem flachen Photoresistfilm zu strukturieren, der konformal auf ein unstrukturiertes Substrat aufgetragen wird.
Wenn die vertikalen Abmessungen der strukturierten Elemente in den nachfolgenden Photolithographieebenen kritisch sind und das Chip- sowie Array-Design dies zulässt, platzieren Sie die Elemente der unteren Ebenen eher an der Peripherie des Arrays. Diese Platzierung reduziert die Variation der Filmdicke des durch Schleuderbeschichtung aufgebrachten Photoresists auf diesen Elementen der unteren Ebene in Bereichen, die näher am Zentrum des Wafers liegen, wo später die Elemente der höheren Ebene platziert werden.
3.2. Anschließend sollten die unteren Ausrichtungsmarken zur Peripherie des Wafers hin platziert werden, um die winklige Ausrichtung zu verbessern und die daraus resultierende radiale Variation der Filmdicke zu verringern; dies sollte an Positionen geschehen, die die Eigenschaften des Chips nicht beeinträchtigen. Eine ideale Platzierung der unteren Ausrichtungsmarken ermöglicht den Einsatz eines einzelnen linearen Klebebands, um mehrere untere Ausrichtungsmarken während der Schleuderbeschichtung des Photoresists abzudecken, ohne dabei Chipstrukturen zu verdecken. Dadurch bleibt die Sichtbarkeit der unteren Ausrichtungsmarken erhalten, während gleichzeitig eine höhere Photolithographiepräzision erreicht wird. Es wird empfohlen, mindestens ein Paar unterer Ausrichtungsmarken für jede höhere Photolithographieebene vorzusehen.
3.3. In diesem dritten Schritt können Sie Strukturelemente des Chips wie mikrofluidische Kanäle, Einlass- und Auslassreservoirs sowie obere Ausrichtungsmarken der Photomaske auf den oberen Designebenen platzieren. Wenn die vertikalen Abmessungen dieser Elemente kritisch sind und das Chip- sowie Dies-Design dies zulässt, können Sie diese Elemente der obersten Ebene näher am Waferzentrum platzieren. Diese Platzierung profitiert von der geringeren Variation der Filmdicke, die sich aus dem Aufbringen des durch Schleuderbeschichtung applizierten Photoresists auf die Elemente der unteren Ebene ergibt, welche optimal an der Peripherie des Dies platziert sind. Somit sollten die unteren Ausrichtungsmarken auf dem Substrat durch die oberen Ausrichtungsmarken auf der Photomaske hindurch sichtbar sein, welche für die Modellierung einer Gussstruktur in einem Negativ-Photoresist größtenteils opak sind.
4. Schließlich können Sie während des Photolithographieprozesses die komplementären Ausrichtungsmarken durch die Photomaske hindurch auf dem Substrat ausrichten.
Strukturierung einer Chip-Gussform
Es gibt viele verschiedene Ansätze zur Herstellung einer Gussform für mikrofluidische Chips, bei denen unterschiedliche Materialien und Methoden zum Einsatz kommen. Am weitesten verbreitet ist ein photolithographischer Ansatz, der sich ideal für das Rapid Prototyping eignet. Er besteht aus der Schleuderbeschichtung und Strukturierung von SU-8, einem epoxidbasierten Negativ-Photoresist, auf einem Siliziumwafer. Die Siliziumform für das obere Substrat wurde durch eine doppellagige SU-8-Strukturierung hergestellt, bei der die erste strukturierte Schicht den Querschnitt der Mikropipetten, der Trapping-Strukturen und des mikrofluidischen Kanals definiert, während die zweite Schicht die Trapping-Strukturen und den Haupt-Mikrofluidikkanal definiert. Die Siliziumform für das untere Substrat wurde durch eine einlagige SU-8-Strukturierung hergestellt, welche die Trapping-Strukturen und den Haupt-Mikrofluidikkanal definiert.
Siliziumform für das obere Substrat
1. Der erste Schritt besteht in der Spin-Coating-Beschichtung (Schleuderbeschichtung) eines nanometrischen Films aus SU-8 2010 auf einen blanken Siliziumwafer.
1.1. Zentrieren Sie dazu den Siliziumwafer mithilfe einer Zentriervorrichtung auf dem Chuck (Ansaugkopf) eines Spin-Coaters.
1.2. Geben Sie etwa 10 ml SU-8 2010 in die Mitte des Wafers und achten Sie darauf, keine Luftblasen zu erzeugen.
1.3. Die erste Schicht des oberen Substrats aus SU-8 2010 wird bei 5000 U/min auf den Siliziumwafer spin-coated, was eine Dicke von 8 µm ergibt.
2. Erhitzen Sie den Siliziumwafer mit dem nanometrischen SU-8-2010-Film für 2 Minuten bei 95 °C auf einer Heizplatte.
3. Anschließend muss die erste photolithographische Belichtung des nanometrischen SU-8-2010-Films durchgeführt werden.
3.1. Platzieren Sie dazu den Siliziumwafer mit dem nanometrischen SU-8-2010-Film und der ersten Photomaske im Maskenaligner (Contact Aligner).
3.2. Bringen Sie den Siliziumwafer mit dem nanometrischen SU-8-2010-Film und die Photomaske in Soft-Contact-Kontakt.
3.3. Verwenden Sie einen i-Line-Filter, um den nanometrischen SU-8-2010-Film bei einer Wellenlänge von 365 nm mit einer Dosis von 80 mJ·cm⁻² zu belichten.
4. Nach der Belichtung wird der Siliziumwafer mit dem nanometrischen SU-8 2010 Film auf einer Heizplatte bei 95 °C für 2 Minuten nachgebacken.
5. Das Muster kann nun in dem belichteten Nanometerfilm aus SU-8 2010 entwickelt werden.
5.1. Tauchen Sie dazu den Siliziumwafer mit dem belichteten Nanometerfilm aus SU-8 2010 unter leichtem Rühren für 1 Minute in SU-8 Entwickler.
5.2. Spülen Sie den Siliziumwafer mit den entwickelten Strukturen aus SU-8 2010 anschließend für 10 s in Isopropanol und trocken Sie ihn mit Stickstoff ab.
6. Backen Sie den Siliziumwafer mit den entwickelten Strukturen aus SU-8 2010 auf einer Heizplatte bei 150 °C für 30 min. Diese Strukturen haften fest auf dem Substrat.
7. Maskieren Sie die Bereiche des Siliziumwafers mit den unteren Ausrichtungsmarken, die im SU-8 2010 strukturiert sind, beispielsweise mit einem 6 mm (0,25 Zoll) breiten Abdeckband. Dieses Abdeckband bedeckt die unteren Ausrichtungsmarken während des Schleuderbeschichtungsverfahrens. Bedecken Sie keine Bereiche des Siliziumwafers, in denen Gerätestrukturen der höheren Ebene strukturiert werden, da dies die Photolithographie in diesen Bereichen verhindern würde.
8. Nun kann der zweite Film aus SU-8 2010 auf den maskierten Siliziumwafer mit den ersten Strukturen aus SU-8 2010 aufgeschleudert werden.
8.1. Zentrieren Sie dazu den Siliziumwafer mit den SU-8 2010 Strukturen mithilfe einer Zentrierhilfe auf dem Chuck einer Zentrifuge.
8.2 Geben Sie etwa 10 ml SU-8 2010 in die Mitte des Wafers und achten Sie darauf, keine Luftblasen zu erzeugen.
8.3 Für die zweite Schicht wird SU-8 2010 mit einer Schleuderdrehzahl von 2000 rpm aufgetragen, was eine Gesamtdicke von 15 µm ergibt.
9. Sie können das Abdeckband nun entfernen.
10. Backen Sie den Wafer mit dem mikroskopischen Film aus SU-8 2010 auf einer Heizplatte bei 95 °C für 8 Minuten.
11. Nun können Sie die zweite photolithographische Belichtung des mikroskopischen Films aus SU-8 2010 durchführen.
11.1. Platzieren Sie dazu den Siliziumwafer mit dem mikroskaligen Film aus SU-8 2010 zusammen mit der zweiten Photomaske für die mikroskaligen Strukturen des Geräts in den Contact Aligner.
11.2. Richten Sie die zuvor gezeichneten Nanometermarken an den mikroskopischen Marken auf der Photomaske aus. Achten Sie darauf, sowohl die oberen als auch die unteren Ausrichtungsmarken exakt auszurichten.
11.3. Bringen Sie den Siliziumwafer mit dem mikroskaligen Film aus SU-8 2010 und die Photomaske in Soft Contact.
11.4. Verwenden Sie einen i-Linien-Filter, um den Film aus SU-8 2010 bei einer Wellenlänge von 365 nm mit einer Dosis von 160 mJ.cm-2 zu belichten.
12. Backen Sie den Siliziumwafer mit dem belichteten mikroskopischen Film aus SU-8 2010 nach der Belichtung auf der Heizplatte bei 95 °C für 8 Minuten.
13. Nun ist es an der Zeit, das Muster im belichteten mikroskopischen Film aus SU-8 2010 zu entwickeln.
13.1. Bereiten Sie dazu zwei SU-8 Entwicklerbehälter vor: einen für die erste grobe Entfernung von SU-8 2010 und einen weiteren für den Reinigungsspülschritt.
13.2 Tauchen Sie den Wafer mit dem belichteten mikroskopischen Film aus SU-8 2010 für 45 s unter leichtem Schwenken in den ersten Behälter.
13.3 Tauchen Sie den Wafer mit dem teilweise entwickelten mikroskopischen Film aus SU-8 2010 für 30 s unter leichtem Rühren in den zweiten Behälter.
13.4. Spülen Sie den Wafer mit dem vollständig entwickelten mikroskopischen Film aus SU-8 2010 mit Isopropanol ab und trocknen Sie ihn mit Stickstoff.
14. Überprüfen Sie die resultierende Gerätematrix (den Formeinsatz) mittels Lichtmikroskopie. Falls Rückstände von SU-8 2010 verbleiben, spülen Sie den Wafer erneut.
Siliziumform für das untere Substrat
Für das untere Substrat wurde eine einzelne Schicht SU-8 2010 mit einer Dicke von 15 µm bei einer Schleuderdrehzahl von 1500 U/min strukturiert.
Es wird empfohlen, die Filmdicke der strukturierten Elemente des SU-8 2010 beispielsweise mit einem Rasterproben-Oberflächenprofilometer oder einem Rasterkraftmikroskop zu messen.
Formgebung eines Chips
Nach der Herstellung der Siliziumformen wurden diese mit PDMS (Sylgard-184) abgegossen. Die Steuerschicht wurde in einem Mischungsverhältnis von 7:1 (Basis:Härter) gegossen. Die Strömungskanalmembran wurde durch Aufschleudern von PDMS mit einem Mischungsverhältnis von 20:1 auf die Siliziumform der Strömungsschicht erzeugt. Wichtig ist, dass die PDMS-Membran den Boden des Strömungskanals bei 30, 25 und 20 psi berührt, für Chips mit PDMS-Schleuderdrehzahlen von 1000, 1200 bzw. 1600 U/min. Nachdem das PDMS-Steuersubstrat gestanzt und Löcher hineingestanzt wurden, wurden sowohl das gestanzte PDMS-Steuersubstrat als auch die PDMS-Strömungsschichtmembran auf der Siliziumform in einen Sauerstoffplasma-Ätzer gegeben. Das gestanzte PDMS-Steuerschichtsubstrat wurde anschließend mithilfe einer maßgeschneiderten Ausrichtungsplattform unter einem Lichtmikroskop sorgfältig mit der PDMS-Strömungsschichtmembran ausgerichtet und verbunden. Eine dünne PDMS-Membran trennt den mikrofluidischen Kanal und die Steuerschichten, die zwei verschiedene Funktionen erfüllen und unabhängig voneinander gesteuert werden. Um den Fluss zu den Fangkammern zu leiten, blockiert ein pneumatisch gesteuerter Ventilsatz oberhalb des mikrofluidischen Kanals den Fluss im Hauptkanal, wenn der Ventilsatz betätigt wird. Ein zweiter Steuerventilsatz direkt über den Fangkammern übt eine Kompression auf die gefangene Doppelemulsion aus, wenn der Ventilsatz betätigt wird. Da die beiden Steuerventilsätze unabhängig voneinander gesteuert werden können, ist das Fangen von der Kompression entkoppelt. Schließlich wurde das PDMS-Substrat mit diesem Objektträger verbunden.
Der mikrofluidische Glaskapillar-Chip wurde hergestellt, indem eine konische Rundkapillare, eine Vierkantkapillare und Kanülen mithilfe von 5-Minuten-Epoxidharz zusammengefügt wurden. Zuerst wurde die runde Glaskapillare mit einem Pipettenzieher gezogen. Die konische Kapillare wurde dann mit Sandpapier der Körnung 1200 abgeschliffen, um eine 100 µm große Öffnung für das Sammel-tube zu erhalten. Die Außenfläche einer sauberen 15 µm Injektionsröhrchenöffnung, die auf ähnliche Weise gezogen und abgeschliffen wurde, wurde mit Trichlor(1H,1H,2H,2H-perfluoroctyl)silan behandelt, um die Oberfläche hydrophob zu machen. Dann wurden das Injektions-tube und das Sammel-tube in eine Vierkantkapillare eingesetzt, die auf einem Objektträger platziert war, und unter einem Lichtmikroskop ausgerichtet. Injektionsnadeln wurden zugeschnitten und mit 5-Minuten-Epoxidharz auf den Objektträger geklebt. Schließlich wurden Mikro-tubings an die Kanülen angeschlossen.
Einfangen von Doppelemulsionen
Doppelemulsionen wurden im mikrofluidischen Chip eingefangen, um mechanische Kräfte auszuüben. Doppelemulsionen mit einem Durchmesser zwischen 40 µm und 90 µm wurden zunächst in einem Glaskapillar-Chip erzeugt und dann mit einer 10-fachen Verdünnung in den mikrofluidischen Chip reinjiziert. Um Doppelemulsionen in den Fangkammern einzufangen, wurde Steuerventilsatz 1 mit einem Druck von 10 bis 15 psi beaufschlagt, um den Hauptkanal zu blockieren, wodurch der Strömungswiderstand im Hauptkanal erhöht wurde. Das Strömungswiderstandsverhältnis zwischen den Mikrokanälen und dem Hauptkanal verringert sich, und mehr Fließlinien strömen durch die Mikrokanäle.
Dies erhöht die Effizienz des Einfangens der Doppelemulsionen erheblich, und es ist möglich, dass alle 14 Fangkammern innerhalb einer Minute gefüllt sind. Eine Doppelemulsion wird eingefangen, wenn ihr Radius kleiner ist als die momentane kritische Strombreite, die durch das Strömungswiderstandsverhältnis zwischen der Mikropipette und dem Hauptkanal bestimmt wird.
