Jede dieser Techniken hat ihre Vor- und Nachteile, und die Wahl hängt von der jeweiligen mikrofluidischen Anwendung ab. Letztendlich kann die genaue Messung der Scherspannung Wissenschaftlern helfen, das Zellverhalten unter Strömungsbedingungen besser zu verstehen.
Was ist die Definition von Scherspannung?
Die Scherspannung ist definiert als die Spannung, die entsteht, wenn eine tangentiale Kraft auf eine Oberfläche wirkt. In der Biologie und Mikrofluidik versteht man unter Scherspannung die Reibungskraft, die bei der Strömung einer biologischen Flüssigkeit auf Zellen oder Gewebe wirkt.Wie lässt sich die Scherspannung bestimmen?
Die Scherspannung einer Flüssigkeit steigt mit der Strömungsgeschwindigkeit und der Viskosität an; daher lässt sie sich für newtonsche Flüssigkeiten gemäß dem Newtonschen Gesetz anhand der folgenden Beziehung berechnen:^{1}:\tau = \eta \frac{\partial v}{\partial z}
wobei \eta Die Viskosität ist die Viskosität (g/cm·s = Poise)\frac{\partial v}{\partial z} ist der Geschwindigkeitsgradient oder die Schergeschwindigkeit (s^{-1}), Im SI-System lautet die Einheit Pascal (Pa), im kardiovaskulären System wird jedoch häufig eine andere Einheit verwendet: dyn/cm² (1 Pa = 10 dyn/cm²).
Die Strömungsgeschwindigkeit ist nicht an jedem Punkt des Kanals gleich, wodurch sich eine Geschwindigkeitsverteilung mit einem Geschwindigkeitsprofil ergibt, das in den meisten einfachen Fällen laminarer Strömung parabolisch verläuft. Die Strömungsgeschwindigkeit ist in der Mitte am höchsten und nahe der Kanalwand am niedrigsten. Bei z = 0 wird die durch die Strömung erzeugte Scherspannung als „Wandscherspannung“ bezeichnet, und der Geschwindigkeitsgradient wird üblicherweise als „Wandschergeschwindigkeit“ bezeichnet. Die Größenordnung der Wandschubspannung ist in der Regel der höchste Wert im Kanal. Bei Experimenten mit adhärenten Zellen oder wenn man die schädlichen Auswirkungen der Schubspannung vermeiden möchte, wird üblicherweise der Wert der Wandschubspannung herangezogen.
Bei der Konzeption eines biologischen Experiments mit Mikrofluidik ist es von entscheidender Bedeutung, die Scherspannung zu berücksichtigen. Das Endziel kann entweder darin bestehen, Scherspannung zu vermeiden und sie auf ein Minimum zu reduzieren, um eine Schädigung der Zellen oder gar deren Absterben zu verhindern, oder aber darin, die in vivo auftretende Scherspannung nachzubilden, um physiologische Prozesse wie beispielsweise die Auswirkungen mechanischer Belastungen auf Zellen zu untersuchen.
Um einen biologischen Prozess nachzubilden, ist es wichtig zu wissen, was in vivo geschieht. In zahlreichen Artikeln wurden dieses Phänomen und die damit verbundenen in-vivo-Folgen beschrieben.
In-vivo-Scherbeanspruchung
Wherever there is flow, shear stress exists. In vivo, shear stress is mostly due to the frictional force of blood flow against the vessel walls. In our body, some cells are continuously under shear stresses such as endothelial cells and kidney epithelial cells but flow patterns are not uniform in the vascular system^{2}:
- In Venen und kleinen Arterien: Im Allgemeinen laminare Strömung; meist wird eine hohe Wandschubspannung beobachtet
- In Verzweigungen und Krümmungen: Gestörtes Strömungsmuster und geringe Wandschubspannung
Die hämodynamischen Kräfte und die daraus resultierende mechanische Belastung lösen zahlreiche biologische Reaktionen aus, die in den letzten Jahrzehnten umfassend beschrieben wurden. Die erste beobachtbare Auswirkung ist eine Veränderung der Morphologie, da sich die Zellen in Strömungsrichtung ausdehnen. Nach Einwirkung von Scherspannung kommt es zudem zu einer deutlichen Reorganisation des Zytoskeletts^{3}, zur Ausrichtung der Mikrotubuli und zu einer Veränderung der Aktinverteilung.
So wurde beispielsweise nachgewiesen, dass Scherspannungen die Genexpression verändern, die Aktivierung von Signalwegen regulieren und einen gewissen Einfluss auf die Kalziumaufnahme, die Differenzierung, die Proliferation und die Proteinexpression haben. Bei steigender Scherspannung werden Proliferationsmechanismen aktiviert.
Darüber hinaus lassen sich vaskuläre Remodellierungsprozesse beobachten, die mit einer Erweiterung des Gefäßdurchmessers und einer Zunahme der Wanddicke einhergehen^{4}. Im Gegensatz dazu führen niedrige Scherspannungswerte zu einer Verringerung des Gefäßdurchmessers.
Das Verhalten von Zellen unter Scherbeanspruchung wurde bereits in zahlreichen Artikeln beschrieben. Je nach Zelllinie können die Auswirkungen unterschiedlich sein.Bei Stammzellen kann dies eine Differenzierung auslösen, und bei Endothelzellen (ECs) hat die Scherbeanspruchung einen enormen Einfluss auf den Phänotyp und kann sogar zu bestimmten Erkrankungen führen.
Beispielsweise kann dies in Bereichen mit oszillierender Scherspannung zu pathologischen Veränderungen an den Arterienwänden führen und das Risiko für Arteriosklerose erhöhen^{5}. Veränderungen der Scherspannung können auch bei Aneurysmen eine Rolle spielen, was auf die Synthese von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS), Stickstoffmonoxid (NO), Wachstumsfaktoren und Metalloproteinasen zurückzuführen ist.
Scherspannung spielt bei verschiedenen biologischen Prozessen auf molekularer und klinischer Ebene eine wichtige Rolle. Mechanische Kräfte werden von den Zellen wahrgenommen und führen zu einer Mechanotransduktion, die biologische Reaktionen auslöst. Im Folgenden finden Sie eine Zusammenfassung der verschiedenen in der Literatur beschriebenen Effekte in Abhängigkeit vom Strömungsmuster und der Scherspannung:
Die Durchschnittswerte der Scherspannung in menschlichen Arterien unter Ruhebedingungen liegen bei etwa 2–20 Dyn/cm². Es ist wichtig darauf hinzuweisen, dass bereits bei einer Scherspannung von nur 4 Dyn/cm² in vivo morphologische Veränderungen beobachtet werden. Deutlich höhere Werte^{6} (von 30 bis 100 Dyn/cm²) lassen sich in der Nähe von Arterienverzweigungen und starken Krümmungen wie dem Aortenbogen oder Bifurkationen beobachten, während in Venen üblicherweise deutlich niedrigere Werte von 1 bis 6 Dyn/cm² gemessen werden.
In-vitro-Scherbeanspruchung
In herkömmlichen 2D-Zellkulturen sind die Zellen keinen mechanischen Kräften wie Scherbeanspruchung, Zug- und Druckkräften ausgesetzt, die sich auf die Entwicklung und Funktion von Organen auswirken.
Wenn beispielsweise kein Flüssigkeitsstrom vorliegt, lässt sich die Wechselwirkung zwischen den untersuchten Zellen und den Blut- sowie Immunzellen nicht beurteilen. Dies stellt eine erhebliche Einschränkung bei Zellkulturstudien dar.
Daher stellt der Einsatz mikrofluidischer Systeme aufgrund ihrer physiologischen Relevanz eine praktikable Alternative zu herkömmlichen In-vitro-Verfahren dar. Die Mikrofluidik kann eine biomimetische 3D-Mikroumgebung schaffen und wird seit kurzem sogar zur Herstellung von „Organen auf einem Chip“ genutzt, um In-vitro-Organe nachzubilden. Diese Anwendungen kommen den Vorgängen im lebenden Organismus näher, doch besteht die neue Herausforderung darin, mechanische Kräfte wie Scherbeanspruchung zu berücksichtigen.
In mikrofluidischen Systemen entsteht durch die Einspeisung der Flüssigkeitsströmung eine Scherspannung. Aufgrund der geringen Abmessungen mikrofluidischer Systeme verläuft die Strömung laminar; daher eignet sich dieses Verfahren gut zur Nachbildung von Strömungen in Venen und kleinen Arterien, wo die Strömung in der Regel unidirektional und laminar ist^{7}. In größeren Arterien sind die Strömungen häufig pulsierend und laminar. In einem mikrofluidischen Experiment kann die Durchflussrate periodisch verändert werden, um diese Strömungsart nachzubilden.
Im Allgemeinen lassen sich die meisten Strömungsmuster mit Mikrofluidik nachbilden; die einzige Ausnahme bildet die turbulente Strömung, die in biologischen Systemen nur selten vorkommt. Mikrofluidik-Experimente stellen daher eine gute In-vivo-Annäherung dar^{8}. Andererseits kann die Scherspannung aufgrund der damit verbundenen nachteiligen Auswirkungen, die bei hohen Werten beobachtet werden, auch als Nachteil angesehen werden. Glücklicherweise ist es möglich, ein mikrofluidisches Experiment so zu konzipieren, dass die Scherspannung keine unerwünschten Auswirkungen hat.
In beiden Fällen – sei es bei der Untersuchung biologischer Phänomene oder wenn die Scherspannung als begrenzender Faktor angesehen wird – ist es entscheidend, sich Zeit zu nehmen und bei der Versuchsplanung bestimmte Parameter zu berücksichtigen.
Mikrofluidik und Scherspannung in Zellversuchen
Unter all den Aspekten, die bei der Konzeption eines mikrofluidischen Experiments zu berücksichtigen sind, ist die Höhe der auf die Zellen einwirkenden Scherspannung ein physiologisch wichtiger Faktor. In mikrofluidischen Systemen beeinflussen mehrere Parameter die Scherspannung: Abmessungen und Geometrie der Kanäle, Zellkonzentration, Art der Zelllinie, Art der Durchflusssteuerung usw. Einige der genannten Parameter werden im Folgenden näher beschrieben, um zu verdeutlichen, wie sich die Scherspannung in mikrofluidischen Systemen steuern und messen lässt.
Entwurf eines Mikrofluidik-Experiments
Nachbildung der in vivo auftretenden Scherspannung: experimentelle Werte
In Experimenten, bei denen statische und biomimetische Bedingungen angestrebt werden, liegt der verwendete Wert zwischen 0,2 und 0,5 Dyn/cm². Um die Strömung durch einen bestimmten Gefäßtyp nachzubilden, können die unten angegebenen Werte für Scherspannungen und Schergeschwindigkeiten als Richtwerte herangezogen werden:
Auswahl der Zelllinien
Die Reaktionen der Zellen auf Scherspannung und ihre Fähigkeit, Flüssigkeitskräften standzuhalten, hängen vom Zelltyp ab. In einigen Studien wurden unter denselben Bedingungen unterschiedliche Zelltypen beobachtet, was zu der Schlussfolgerung führte, dass es je nach verwendetem Zelltyp ein breites Spektrum an Reaktionen auf Scherspannung gibt. Ein Schritt des Design-Experiments besteht darin, herauszufinden, welche Zelllinien verwendet und welche Durchflussrate je nach gewünschtem Ergebnis eingesetzt werden sollten.
Chip-Design
In jedem Fluidsystem ist die Fähigkeit, die Scherspannung vorherzusagen, von großer Bedeutung, um die Auswirkungen auf den Phänotyp der Zellen abzuschätzen^{11}. Daher ist es bei der Konzeption eines Experiments und eines neuen Mikrofluidik-Chipkann die Scherspannung berechnet oder modelliert werden.
Auswahl des Durchflussregelsystems
In der Mikrofluidik und bei Zellversuchen ist eine präzise und gleichmäßige Strömungssteuerung von entscheidender Bedeutung. Da dies ein Schlüsselparameter für die Steuerung der Scherspannung ist, kommt der Wahl des Strömungssteuerungsinstruments große Bedeutung zu.
Es gibt verschiedene Möglichkeiten, wie zum Beispiel Spritzenpumpen, Schlauchpumpen, oder Druckregelsysteme mit oder ohne Durchflussschaltern. Jedes dieser Systeme hat seine Vor- und Nachteile, und die Wahl hängt von der mikrofluidischen Anwendung ab. Die folgende Übersicht geht näher auf die jeweiligen Vor- und Nachteile gängiger Durchflussregelungsmethoden ein.
Bei der Behandlung von Scherspannungen gibt es wesentliche Nachteile, die es zu vermeiden gilt: lange Ansprechzeiten, unerwünschte Schwankungen der Durchflussmenge und unkontrollierbare Schwankungen. Diese Nachteile können zu einer erheblichen Abweichung zwischen der berechneten bzw. simulierten Durchflussmenge und der tatsächlichen Durchflussmenge führen. Um eine Durchflussmenge zu erzielen, die dem Sollwert möglichst nahekommt, sowie eine schnelle Ansprechzeit und eine präzise Durchflussregelung zu gewährleisten, kann ein Druckregelsystem eine der besten Lösungen auf dem Markt sein.
Wie misst man die Scherspannung?
Die Bestimmung der Scherspannung in einer Zellkultur unter Strömung kann auf verschiedene Weise erfolgen. Die Scherspannung lässt sich mithilfe theoretischer und numerischer Methoden der Strömungsmechanik bestimmen. Um die Strömung und damit die Scherspannung in einem mikrofluidischen System zu berechnen, muss man die Navier-Stokes-Gleichung entweder numerisch oder analytisch lösen, um das Geschwindigkeitsprofil für die betrachtete Geometrie zu ermitteln. Bei einfachen Geometrien wie einem breiten rechteckigen Kanal oder einem röhrenförmigen Kanal ist die analytische Lösung einfach und in der Literatur zu finden. Beispielsweise lässt sich für einen rechteckigen Kanal mit den Abmessungen w*h*l bei h>w>>l die Wandschubspannung wie folgt berechnen: \tau=\frac{6\eta Q}{h²W}, wobei Q den Durchfluss darstellt. Für einen zylindrischen Kanal beträgt die Schubspannung \tau=\frac{4\eta Q}{R^{3}}/\pi.
Diese einfachen Formeln geben jedoch die Scherspannung bei komplexen Geometrien nicht wieder; in solchen Fällen ist es in der Regel besser, eine Computersimulation durchzuführen, um die Scherspannung oder die Schergeschwindigkeit abzuschätzen.
Diese Berechnungen sind sehr nützlich, um die Scherspannung abzuschätzen – sogar präzise. Möchte man jedoch die Scherspannung in einem mikrofluidischen Experiment so genau wie möglich experimentell ermitteln, stehen verschiedene Methoden zur Verfügung, die eine lokale Messung oder Abschätzung der Scherspannung im interessierenden Bereich ermöglichen. Wir haben ein einfaches (aber praktisches) Tool entwickelt, das Ihnen dabei hilft, den ungefähren Druck in Ihrem Chip zu bestimmen.
Für Untersuchungen in Zellkulturen kann es wünschenswert sein, die Scherspannung so nah wie möglich an den Zellen zu messen. Hierfür gibt es verschiedene Messverfahren.
Zellbasierter Sensor
Durch die Strömungsschubspannung kann es zur Aktivierung bestimmter Signalwege kommen^{12}. Eine Methode, die zur Messung der Schubspannung entwickelt wurde, sind genetisch kodierte fluoreszierende Zellsensoren, die auf die Aktivierung von Signalwegen durch die Strömungsschubspannung reagieren.
Flüssigkristall
In mikrofluidischen Systemen wurde das Potenzial von Flüssigkristallen als Verfahren zur Scherungsmessung aufgezeigt^{13}. Diese experimentelle Technik basiert auf den Eigenschaften von Flüssigkristallen und deren chiralen Molekülstrukturen. Bei Einwirkung einer Scherspannung verbiegt sich die Molekülstruktur, was zu einer messbaren Änderung der Polarisation oder der Wellenlänge führen kann.
Mikropartikel-Geschwindigkeitsmessung
Mit Hilfe von Mikropartikel-Velozimetrie-Systemen (µ-PIV) lässt sich die Wandschubspannung präzise erfassen, wobei auch die Zelloberfläche direkt abgebildet werden kann^{14}. Dies ermöglicht die Messung des Strömungsprofils zur Bestimmung der Schubspannung. Ein µ-PIV-System besteht aus einer Hochgeschwindigkeitskamera, die mit einem Doppelresonator-Laser synchronisiert ist, der in die Flüssigkeitsströmung eingebrachte Partikel beleuchtet und deren Position mit hoher Genauigkeit erfasst. Solche Systeme sind zwar sehr leistungsfähig, doch aufgrund der Komplexität ihrer Umsetzung eignen sie sich nicht für eine einfache Messung der Scherspannung.
Laser-Doppler-Velozimetrie
Eine weitere Methode zur Messung von Geschwindigkeitsprofilen in Flüssigkeitsströmungen nahe der Grenzfläche ist die Nutzung der Dopplerverschiebung von Laserlicht^{15}. Dabei wird die Dopplerverschiebung eines innerhalb der Strömung reflektierten Laserlichts überwacht, um das Strömungsprofil der Flüssigkeit zu messen und die Scherspannung zu bestimmen. Die Apparatur für eine solche Messung ist einfacher als bei der Bildvelozimetrie, da der Laser nicht mit einer Kamera und lediglich seine Frequenzverschiebung gemessen werden muss; allerdings ist das Verfahren weniger gut dokumentiert und die Ergebnisse sind nicht so präzise.
Dennoch handelt es sich hierbei um eine wirklich vielversprechende Alternative für die kostengünstige Durchflussmessung und die Bestimmung der Scherspannung in unmittelbarer Nähe der Zellen.
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