Jede dieser Techniken hat ihre Vor- und Nachteile, und die Wahl hängt von der jeweiligen mikrofluidischen Anwendung ab. Letztendlich kann eine präzise Messung der Schubspannung Wissenschaftlern helfen, das Zellverhalten unter Strömungsbedingungen besser zu verstehen.
Wie lautet die Definition der Schubspannung?
Schubspannung ist definiert als die Spannung, die entsteht, wenn eine Tangentialkraft auf eine Oberfläche wirkt. In der Biologie und Mikrofluidik bezeichnet die Schubspannung die Reibungskraft einer biologischen Flüssigkeitsströmung, die auf Zellen oder Gewebe einwirkt.Wie bestimmt man die Schubspannung?
Die fluidische Schubspannung nimmt mit der Fließgeschwindigkeit und der Viskosität zu. Daher lässt sie sich für Newtonsche Fluide nach dem Newtonschen Gesetz mit folgender Beziehung berechnen^{1}:\tau =\eta \frac{\partial v}{\partial z}
wobei \eta die Viskosität ist (g/cm-s = Poise)\frac{\partial v}{\partial z} ist der Geschwindigkeitsgradient oder die Schergeschwindigkeit (s^{-1}), Im SI-System ist die Einheit Pascal (Pa), im kardiovaskulären System wird jedoch häufig eine andere Einheit verwendet: dyn/cm² (1 Pa = 10 dyn/cm²).
Die Flüssigkeitsströmung weist nicht an jedem Punkt im Kanal dieselbe Geschwindigkeit auf, wodurch eine Geschwindigkeitsverteilung mit einem Profil entsteht, das in den meisten einfachen Fällen einer laminarer Strömung parabolisch verläuft. Die Fluidgeschwindigkeit ist in der Mitte am höchsten und an der Kanalwand am geringsten. Wenn z=0 ist, wird die durch das Fluid erzeugte Schubspannung als „Wandschubspannung“ und der Geschwindigkeitsgradient gewöhnlich als „Wandscherrate“ bezeichnet. Die Wandschubspannung weist im Kanal üblicherweise den höchsten Betrag auf. Bei Experimenten mit adhärenten Zellen oder wenn schädliche Auswirkungen der Schubspannung vermieden werden sollen, wird in der Regel der Wert der Wandschubspannung herangezogen.
Bei der Konzeption eines biologischen Experiments im Bereich der Mikrofluidik ist die Berücksichtigung der Schubspannung von entscheidender Bedeutung. Das Endziel kann darin bestehen, die Schubspannung zu vermeiden und auf ein Minimum zu reduzieren, um Zellschäden oder gar den Zelltod zu verhindern, oder sie gezielt nachzubilden (In-vivo-Schubspannung), um physiologische Prozesse wie die Auswirkungen mechanischer Spannungen auf Zellen zu untersuchen.
Um einen biologischen Prozess zu reproduzieren, ist es wichtig zu wissen, welche Abläufe in vivo stattfinden. Zahlreiche Fachartikel haben dieses Phänomen und dessen In-vivo-Konsequenzen beschrieben.
In-vivo-Schubspannung
Wherever there is flow, shear stress exists. In vivo, shear stress is mostly due to the frictional force of blood flow against the vessel walls. In our body, some cells are continuously under shear stresses such as endothelial cells and kidney epithelial cells but flow patterns are not uniform in the vascular system^{2}:
- In Venen und kleinen Arterien: Es werden im Allgemeinen eine laminare Strömung und hohe Wandschubspannungen beobachtet.
- In Verzweigungen und Krümmungen: Gestörte Strömungsprofile und geringe Wandschubspannungen.
Die hämodynamischen Kräfte und die daraus resultierenden mechanischen Belastungen rufen zahlreiche biologische Reaktionen hervor, die in den letzten Jahrzehnten gut dokumentiert wurden. Die erste beobachtbare Auswirkung ist eine morphologische Veränderung, bei der sich die Zellen in Strömungsrichtung elongieren. Nach der Einwirkung von Schubspannung kommt es zudem zu einer deutlichen Reorganisation des Zytoskeletts^{3}, der Ausrichtung der Mikrotubuli und einer Veränderung der Aktinverteilung.
Es hat sich beispielsweise gezeigt, dass Schubspannungen die Genexpression verändern, die Aktivierung von Signalwegen regulieren und Einfluss auf die Calciumaufnahme, Differenzierung, Proliferation sowie Proteinexpression nehmen. Bei steigender Schubspannung werden Proliferationsmechanismen aktiviert.
Darüber hinaus lassen sich vaskuläre Remodellierungsprozesse mit einer Vergrößerung des Gefäßdurchmessers und einer Zunahme der Wandstärke beobachten^{4}. Im Gegensatz dazu führen geringe Schubspannungswerte zu einer Verringerung des Gefäßdurchmessers.
Das Zellverhalten unter Schubspannung wurde in zahlreichen Publikationen beschrieben. Je nach Zelllinie kann die Auswirkung unterschiedlich sein. Bei Stammzellen kann sie eine Differenzierung induzieren, während sie bei Endothelzellen (ECs) einen massiven Einfluss auf den Phänotyp hat und sogar zu Pathologien führen kann.
So kann sie beispielsweise in Regionen mit oszillierender Schubspannung zu pathologischen Veränderungen der Arterienwände führen und das Risiko für Atherosklerose erhöhen^{5}. Veränderungen der Schubspannung können zudem bei der Entstehung von Aneurysmen eine Rolle spielen, was auf die Synthese reaktiver Sauerstoffspezies (ROS), Stickstoffmonoxid (NO), Wachstumsfaktoren und Metalloproteinasen zurückzuführen ist.
Schubspannung spielt eine wichtige Rolle bei verschiedenen biologischen Prozessen auf molekularer und klinischer Ebene. Mechanische Kräfte werden von den Zellen wahrgenommen, was zu einer Mechanotransduktion in biologische Reaktionen führt. Nachfolgend ist eine Zusammenfassung der verschiedenen in der Literatur beschriebenen Effekte aufgeführt, abhängig von Strömungsprofil und Schubspannung:
Durchschnittliche Werte der Schubspannung in menschlichen Arterien unter Basalbedingungen liegen bei etwa 2–20 dyn/cm². Es ist wichtig hervorzuheben, dass selbst bei einer so geringen Schubspannung wie 4 dyn/cm² in vivo morphologische Veränderungen beobachtet werden. Viel höhere Werte^{6} (von 30 bis 100 dyn/cm²) sind in der Nähe von arteriellen Verzweigungen und starken Krümmungen wie dem Aortenbogen sowie Bifurkationen zu beobachten, während in Venen üblicherweise deutlich geringere Werte von 1 bis 6 dyn/cm² gemessen werden.
In-vitro-Schubspannung
In herkömmlichen 2D-Zellkulturen sind Zellen keinen mechanischen Kräften wie Schubspannung, Zug und Kompression ausgesetzt, die einen direkten Einfluss auf die Organentwicklung und -funktion haben.
Beispielsweise kann bei fehlender Fluidströmung die Interaktion der untersuchten Zellen mit Blut- und Immunzellen nicht bewertet werden. Dies stellt eine erhebliche Einschränkung von Zellkulturstudien dar.
Daher ist die Verwendung mikrofluidischer Systeme aufgrund ihrer physiologischen Relevanz eine praktikable Alternative zu traditionellen In-vitro-Techniken. Die Mikrofluidik kann eine biomimetische 3D-Mikroumgebung bereitstellen und wird in jüngerer Zeit sogar für Organs-on-a-Chip eingesetzt, um Organe in vitro nachzubilden. Diese Anwendungen kommen den Vorgängen in vivo sehr viel näher, wobei die neue Herausforderung darin besteht, mechanische Kräfte wie die Schubspannung zu berücksichtigen.
In mikrofluidischen Systemen wird die Schubspannung durch die Fluidinjektion erzeugt. Aufgrund der geringen Abmessungen mikrofluidischer Geräte ist die Strömung laminar, weshalb dies eine gute Methode darstellt, um Strömungen in Venen und kleinen Arterien nachzubilden, in denen die Strömung gewöhnlich unidirektional und laminar ist^{7}. In größeren Arterien sind die auftretenden Strömungen oft pulsatil und laminar. In einem mikrofluidischen Experiment kann die Flussrate periodisch angepasst werden, um diesen Strömungstyp zu imitieren.
Im Allgemeinen lassen sich die meisten Strömungsmuster mit der Mikrofluidik nachbilden; die einzige Ausnahme bildet die turbulente Strömung, die in biologischen Systemen nur selten vorkommt. Mikrofluidische Experimente stellen daher eine gute In-vivo-Annäherung dar^{8}. Andererseits kann die Schubspannung aufgrund der inhärenten schädlichen Effekte bei hohen Werten auch als Nachteil angesehen werden. Glücklicherweise ist es möglich, ein mikrofluidisches Experiment so auszulegen, dass die Schubspannung keine unerwünschten Auswirkungen hat.
In beiden Situationen – sei es bei der Untersuchung biologischer Phänomene oder wenn die Schubspannung als limitierender Faktor angesehen wird –, ist es von entscheidender Bedeutung, sich die Zeit zu nehmen und bestimmte Parameter bei der Versuchsplanung zu berücksichtigen.
Mikrofluidik und Schubspannung in Zellexperimenten
Unter allen zu berücksichtigenden Aspekten bei der Konzeption eines mikrofluidischen Experiments ist das Niveau der auf die Zellen einwirkenden Schubspannung ein physiologisch bedeutsamer Faktor. In mikrofluidischen Systemen beeinflussen mehrere Parameter die Schubspannung: Abmessungen und Geometrie der Kanäle, Zellkonzentration, Zelllinientyp, Art der Flussratenförderung usw. Einige dieser genannten Parameter werden detaillierter beschrieben, um zu verstehen, wie die Schubspannung in mikrofluidischen Systemen kontrolliert und gemessen werden kann.
Entwurf eines mikrofluidischen Experiments
Nachbildung der In-vivo-Schubspannung: Experimentelle Werte
In Experimenten, in denen statische und biomimetische Bedingungen erwünscht sind, liegt der verwendete Wert zwischen 0,2 und 0,5 dyn/cm². Um die Strömung durch einen bestimmten Gefäßtyp nachzubilden, können die unten aufgeführten Werte für Schubspannungen und Scherraten als Referenz herangezogen werden:
Auswahl der Zelllinien
Zellreaktionen auf Schubspannung und ihre Fähigkeit, Fluidkräften zu widerstehen, hängen vom jeweiligen Zelltyp ab. In einigen Studien wurden verschiedene Zelltypen unter denselben Bedingungen beobachtet, was zu dem Schluss führte, dass es ein breites Spektrum an Reaktionen auf Schubspannung gibt, das vom verwendeten Zelltyp abhängt. Ein Schritt bei der Versuchsplanung besteht darin, herauszufinden, welche Zelllinien verwendet werden sollten und welche Flussrate je nach angestrebtem Ergebnis anzuwenden ist.
Chiptest-Design
In jedem Fluidsystem ist die Fähigkeit, die Schubspannung vorherzusagen, von großer Bedeutung, um die Konsequenzen für den Zellphänotyp zu prognostizieren^{11}. Daher kann die Schubspannung bei der Entwicklung eines Experiments und eines neuen mikrofluidischen Chips berechnet oder modelliert werden.
Auswahl des Durchflussregelsystems
In der Mikrofluidik und bei Zellexperimenten ist eine präzise und gleichmäßige Durchflussregelung von entscheidender Bedeutung. Dies ist ein Schlüsselparameter zur Steuerung der Schubspannung, weshalb die Wahl des Durchflussregelgeräts von großer Wichtigkeit ist.
Es existieren verschiedene Optionen wie Spritzenpumpen, Peristaltikpumpen oder Druchregelsysteme mit oder ohne Flow-Switches. Jedes dieser Systeme hat seine Vor- und Nachteile, und die Auswahl hängt von der jeweiligen mikrofluidischen Anwendung ab. Der folgende Übersichtsartikel geht näher auf die relativen Vor- und Nachteile gängiger Durchflussregelungs Methoden ein.
Im Umgang mit Schubspannung müssen wesentliche Nachteile vermieden werden: langsame Ansprechzeiten, unerwünschte Flussratenoszillationen und nicht kontrollierbare Schwankungen. Diese Nachteile können zu einer erheblichen Abweichung zwischen der berechneten/simulierten Flussrate und der tatsächlichen Flussrate führen. Um eine Flussrate zu erzielen, die dem gewünschten Wert möglichst nahekommt, sowie eine schnelle Ansprechzeit und eine präzise Flussregelung zu gewährleisten, kann ein Druckregelsystem eine der besten Lösungen auf dem Markt sein.
Wie misst man Schubspannungen?
Die Bewertung der Schubspannung in einer Zellkultur unter Fluss kann auf verschiedene Weise erfolgen. Die Schubspannung lässt sich mithilfe theoretischer und numerischer Strömungsmechanik ermitteln. Um die Strömung und damit die Schubspannung in einem mikrofluidischen Aufbau zu berechnen, müssen die Navier-Stokes-Gleichungen entweder numerisch oder analytisch gelöst werden, um das Geschwindigkeitsprofil für die betrachtete Geometrie zu ermitteln. Bei einfachen Geometrien wie einem breiten rechteckigen Kanal oder einem rohrförmigen Kanal ist die analytische Lösung einfach und in der Literatur zu finden. Beispielsweise kann für einen rechteckigen Kanal mit den Abmessungen w*h*l und h>w>>l die Wand Schubspannung als \tau=\frac{6\eta Q}{h²W} berechnet werden, wobei Q die Flussrate ist. Für einen zylindrischen Kanal beträgt die Schubspannung \tau=\frac{4\eta Q}{R^{3}}/\pi.
Diese einfachen Formeln bilden die Schubspannung bei komplexen Geometrien jedoch nicht ab; hier ist es im Allgemeinen ratsam, eine Computersimulation durchzuführen, um die Schubspannung oder die Scherrate abzuschätzen.
Diese Berechnungen sind äußerst nützlich, um die Schubspannung präzise abzuschätzen. Wenn man die Schubspannung in einem mikrofluidischen Experiment jedoch so genau wie möglich auf experimentelle Weise ermitteln möchte, stehen verschiedene Methoden zur Verfügung, die eine lokale Messung oder Abschätzung der Schubspannung im Interessengebiet ermöglichen. Wir haben ein einfaches (aber praktisches) Tool entwickelt, mit dem Sie den ungefähren Druck in Ihrem Chip bestimmen können.
Für Untersuchungen an Zellkulturen kann es wünschenswert sein, die Schubspannung so nah wie möglich an den Zellen zu messen. Hierfür gibt es verschiedene Sensormethoden.
Zellbasierter Sensor
Strömungsbedingte Schubspannungen können zur Aktivierung bestimmter Signalwege führen^{12}. Eine Methode zur Messung der Schubspannung sind genetisch kodierte fluoreszierende Zellsensoren, die auf die Aktivierung des Strömungsschubspannungs-Signalwegs reagieren.
Flüssigkristalle
Die potenzielle Verwendung von Flüssigkristallen als Technik zur SchubspannungsMessung wurde in mikrofluidischen Systemen nachgewiesen^{13}. Diese experimentelle Technik basiert auf den Eigenschaften von Flüssigkristallen und deren chiraler molekularer Struktur. Wenn eine Schubspannung einwirkt, verbogen sich die molekularen Strukturen, was zu einer messbaren Änderung der Polarisation oder der Wellenlänge führen kann.
Mikro-Partikel-Velozimetrie
Mikro-Partikel-Velozimetrie-Systeme (µ-PIV) können verwendet werden, um präzise Messwerte der Wandschubspannung zu erhalten, die auch die Zelloberfläche direkt auflösen können^{14}. Dies ermöglicht die Messung des Strömungsprofils zur Bestimmung der Schubspannung. Ein µ-PIV-System besteht aus einer Hochgeschwindigkeitskamera, die mit einem doppelgepulsten Laser synchronisiert ist; dieser beleuchtet Partikel im Flüssigkeitsstrom und überwacht deren Position mit hoher Genauigkeit. Solche Systeme sind äußerst leistungsstark, aber die Komplexität ihrer Implementierung macht sie für einfache Schubspannungs-Messungen ungeeignet.
Laser-Doppler-Velozimetrie
Eine weitere Möglichkeit zur Messung von Geschwindigkeitsprofilen in Flüssigkeitsströmen nahe der Grenzfläche ist die Nutzung der Doppler-Verschiebung von Laserlicht^{15}. Dabei wird die Doppler-Verschiebung des im Fluss reflektierten Laserlichts überwacht, um das Strömungsprofil der Flüssigkeit zu messen und die Schubspannung zu bestimmen. Die Apparatur für eine solche Messung ist einfacher als bei der Bild-Velozimetrie, da der Laser nicht mit einer Kamera synchronisiert werden muss und man lediglich die Frequenzverschiebung messen muss; allerdings ist dieses Verfahren weniger gut dokumentiert und die Ergebnisse sind nicht ganz so präzise.
Dennoch ist dies eine sehr vielversprechende Alternative für kostengünstige Durchflussmessungen und die Bewertung von Schubspannungen in unmittelbarer Nähe der Zellen.
Literaturverzeichnis
- Transport phenomena, R. B. Bird, W. E. Stewart, and E. N. Lightfoot, John Wiley and Sons, Inc., New York(1960). 780 pages.$11.50. (1961). AIChE Journal, 7(2), pp.5J-6J.
- Chiu, J. and Chien, S. (2011). Effects of Disturbed Flow on Vascular Endothelium: Pathophysiological Basis and Clinical Perspectives. Physiological Reviews, 91(1), pp.327-387.
- Malek, A., Izumo S. (1996). Mechanism of endothelial cell shape change and cytoskeletal remodeling in response to fluid shear stress. J Cell Sci, (Pt 4):713-26.
- Glagov, S., Zarins, C. and Giddens, D. (1994). Hemodynamics, the structure of the artery wall and atherosclerosis. Atherosclerosis, 109(1-2), p.343.
- Davies, P. (2008). Hemodynamic shear stress and the endothelium in cardiovascular pathophysiology. Nature Clinical Practice Cardiovascular Medicine, 6(1), pp.16-26.
- Dewey, C., Bussolari, S., Gimbrone, M. and Davies, P. (1981). The Dynamic Response of Vascular Endothelial Cells to Fluid Shear Stress. Journal of Biomechanical Engineering, 103(3), p.177.
- Franklin, K. J. (1937). Veins and the nervous system. In “A Monograph on Veins” (K. J. Franklin, ed.), Chapter 10.
- Freund, J., Goetz, J., Hill, K. and Vermot, J. (2012). Fluid flows and forces in development: functions, features and biophysical principles. Development, 139(16), pp.3063-3063.
- Papaioannou TG(1), Stefanadis C. (2005) Vascular wall shear stress: basic principles and methods. Hellenic J Cardiol 46(1):9-15.
- Kim, L., Toh, Y., Voldman, J. and Yu, H. (2007). A practical guide to microfluidic perfusion culture of adherent mammalian cells. Lab on a Chip, 7(6), p.681.
- Barber, R. und Emerson, D. (2007). Optimal design of microfluidic networks using biologically inspired principles. Microfluidics and Nanofluidics, 4(3), S. 179-191.
- Varma, S. und Voldman, J. (2015). A cell-based sensor of fluid shear stress for microfluidics. Lab Chip, 15(6), S. 1563-1573.
- Martel, J., Bradford, A. Bruno, (2008). Shear stress measurement in Microfluidic systems: Liquid Crystal Technique. ASME, S. 2009-2018; 10 Seiten
- Rossi, M., Lindken, R., Hierck, B. P., & Westerweel, J. (2009). Tapered microfluidic chip for the study of biochemical and mechanical response at subcellular level of endothelial cells to shear flow. Lab on a Chip, 9(10), 1403-1411.
- Campagnolo, L., Nikolić, M., Perchoux, J., Lim, Y. L., Bertling, K., Loubiere, K., … & Bosch, T. (2013). Flow profile measurement in microchannel using the optical feedback interferometry sensing technique. Microfluidics and Nanofluidics, 14(1-2), 113-119.
