Die auf Mikrofluidik basierende hydrodynamische Falle erleichtert das Einfangen ausschließlich durch die Einwirkung des Fluidflusses und stellt eine praktikable Alternative zu bestehenden Einschluss- und Manipulationstechniken dar, die beispielsweise auf elektrischen, optischen, magnetischen oder akustischen Kraftfeldern basieren. In diesem Übersichtsartikel beschreiben wir verschiedene Methoden und Techniken, die beim mikrofluidischen Einfangen von Sphäroiden und single-cells eingesetzt werden.
Prozesse zum Einfangen von single-cells
Eine der robustesten Methoden zur Analyse von single-cell-Populationen mit relativ hohem Durchsatz sind Mikrowell-Arrays.
Ein wiederkehrendes Problem besteht jedoch darin, dass Mikrowell-Kulturen statisch sind. Dies schränkt ihre Fähigkeit ein, die eingefangenen Zellen aktiv zu manipulieren, beispielsweise um das Medium zu wechseln oder die Exposition der Zellen gegenüber mitogenen Reizen zu steuern. Andererseits ermöglichen mikrofluidische Ventile, optische Pinzetten, Dielektrophorese (DEP) und akustische Wellen, die sich leicht in mikrofluidische Chips integrieren lassen, leistungsstärkerte Ansätze zum Einfangen und Manipulieren einzelner Zellen.
In dieser Übersicht haben wir uns auf die Studie von Koben et al. aus dem Jahr 2018 gestützt, in der sie die Fangraft entsprechend verschiedener Chip-Designs bewerten konnten. In ihrer Studie präsentieren Koben et al. ein mikrofluidisches Gerät, das in der Lage ist, eine einzelne Zelle über ein Netzwerk von Fallen einzufangen, bei denen die Hauptkanallänge 1, 2 oder 4 mm betragen kann, mit jeweils 64 Fallen parallel und 3 bis 10 Fallen in Reihe. Jeder Chip verfügt dementsprechend über zwei Einlässe: einen für die Mediumzufuhr und einen für das Laden der Zellen.
In der Praxis wurde der Chip zunächst mit vollständigem Zellkulturmedium bei einer Flussrate von 25 ml/min gespült, und die Zellen wurden durch den Ersatzeinlass injiziert. Nach dem Verschließen des Zelleinlasses mit einem Stopfen wurde der Chip auf ein Inversmikroskop platziert, mit einer Flussrate von 20 nl/min beaufschlagt und das Verhältnis zwischen erfolgreichen und erfolglosen Fallen quantifiziert. Um eine ausreichend große Anzahl von Fangereignissen für eine statistische Analyse zu untersuchen, wurden die bereits eingefangenen Zellen durch Umkehrung der Flussrichtung für etwa 1,5 bis 2 Sekunden aus den Fallen entfernt und die Infusion neu gestartet.
Ein weiteres intelligentes Gerät wurde entwickelt, um das Laden einer Vollblutprobe zu ermöglichen (Abb. 1 B). Es besteht aus einem Vollbluteinlass, einem Puffereinlass und einem Bifurkationsbereich, der zu drei Blutzellen-Sammelbereichen führt: einem Plasmabereich, einem Bereich für rote Blutkörperchen (RBC) und einem Bereich für weiße Blutkörperchen (WBC). Der Trennungsmechanismus für rote und weiße Blutkörperchen basiert auf dem Bifurkationsgesetz und der Querstrommethode (mit Kochsalzlösung). Der Bifurkationsbereich enthält sechs mit Beads gefüllte Seitenkanäle, vier verengte Seitenkanäle und einen Hauptkanal für die Plasmaextraktion, die Extraktion roter Blutkörperchen beziehungsweise das Einfangen weißer Blutkörperchen. Um ein gleichmäßiges Flussprofil im Bifurkationsbereich zu erreichen, wurden alle Seitenkanäle in einem Winkel von 60 Grad zum Hauptkanal geneigt.
Typischerweise haben Erythrozyten (RBCs) einen Durchmesser von 6,2–8,2 µm und eine Dicke von 2–2,5 µm, während Leukozyten (WBCs) einen Durchmesser von 7–18 µm aufweisen. Aufgrund der Dichte der 10-µm-Kügelchen im Seitenkanal beträgt die effektive Porengröße 1,55 µm. Daher passieren alle Blutzellen die Vorrichtung und nur Plasma kann im Plasmabereich zirkulieren und gesammelt werden.
Prozesse zum Einfangen von Sphäroiden
U-förmige Mikrostrukturen
Die U-förmigen Mikrostrukturen arbeiten entweder temporär durch pneumatische Betätigung oder permanent im Inneren des Geräts. Viele dieser U-förmigen Mikrostrukturen sind in der Regel integriert. Der Durchmesser der Sphäroiden hängt von der Größe der Mikrostruktur ab, während die relative Position der Mikrostrukturen für ein effektives Einfangen der Zellen essenziell ist.
Darüber hinaus ist es möglich, den Zeitpunkt der Sphäroidbildung über die Flussrate zu steuern. Hohe Flussraten führen jedoch dazu, dass die Zellen aus der Falle entkommen. Um die Sphäroide hingegen in den Mikrostrukturen zu halten, muss der Fluss und damit der erforderliche Staudruck aufrechtchterhalten werden.
Auf Mikrowells basierende mikrofluidische Sphäroid-Bildungschips (µSFC)
Im Allgemeinen benötigt ein auf Mikrowells basierender µSFC eine bestimmte Anzahl von Mikrowells und ein Mikrokanalnetzwerk zur Zufuhr des Kulturmediums. Mikrokanäle sollten so gestaltet sein, dass sie ein unerwünschtes Entweichen der Sphäroide aus den Mikrowells verhindern. Experimentell hat sich gezeigt, dass eine Vergrößerung der Kanalbreite oder eine Verringerung der Kanaleinhöhe das Entweichen von Sphäroiden einschränken kann.
Um die Flussraten über mehrere Mikrokanäle hinweg anzugleichen, muss der Strömungswiderstand in allen Kanälen gleich sein. Wenn die Kanäle also die gleiche Breite und Höhe aufweisen, müssen auch ihre Längen identisch sein, um diese Anforderung zu erfüllen. Schlangenlinienförmige Kanäle, die häufig in Konzentrationsgradientengeneratoren (CGGs) als Mischkanäle verwendet werden, eignen sich dazu, die Kanallänge auf einer kleinen Fläche des Chips präzise anzupassen. Solche Kanäle können somit eher zur Flussregelung eingesetzt werden, als dass Ventile in mikrofluidische Chips integriert werden müssen. Bei den gewünschten Flussraten müssen zudem die Anzahl der im Kulturmilieu vorhandenen Zellen und deren entsprechender Bedarf an Sauerstoff, Nährstoffen und anderen Faktoren berücksichtigt werden.
Es gibt zahlreiche Geräte, die verwendet werden können, um organisierte Zellen, sogenannte Sphäroide oder Organoide, einzufangen. In Abbildung 3 stellen wir einige dieser Geräte vor.
