I liposomi, o nanoparticelle lipidiche, sono vescicole chiuse ampiamente utilizzate per l’incapsulamento di diversi tipi di molecole, quali DNA, proteine, farmaci e/o altre sostanze chimiche. In questa breve rassegna, tratteremo i metodi di preparazione più diffusi, con particolare attenzione alla microfluidica.
Un involucro liposomiale è un doppio strato fosfolipidico che funge da membrana biomimetica e racchiude un compartimento liquido, come illustrato schematicamente nella Fig. 1. Grazie alla loro biocompatibilità estremamente elevata, i liposomi trovano utili applicazioni in diversi campi e lo sviluppo di metodi di preparazione affidabili riveste grande importanza.
Indipendentemente dai metodi di preparazione, i fosfolipidi sono molecole anfifiliche che, in soluzione acquosa, si organizzano spontaneamente in liposomi grazie alla loro idrofobicità. Questo processo riduce le interazioni sfavorevoli tra le catene aciliche idrofobiche e la fase acquosa circostante.
A seconda del metodo specifico utilizzato per la preparazione dei liposomi, le dimensioni, la lamellarità e la dispersione dei liposomi ottenuti possono variare notevolmente. Le vescicole lipidiche utilizzate in ambito medico sono in genere unilamellari e hanno un diametro di circa 100 nm.
Dispositivi microfluidici per la preparazione di liposomi
I metodi più antichi e tradizionali per la preparazione dei liposomi consistono nelle cosiddette tecniche su macroscala o in batch, basate sulla disidratazione iniziale dei film lipidici, seguita dal processo di rigonfiamento e dalla manipolazione meccanica finale per creare i doppi strati dispersi in acqua. Tuttavia, questi metodi sono caratterizzati da scarsa riproducibilità, controllo limitato del processo e uso inefficiente di materiali e reagenti.
La microfluidica è stata recentemente studiata come metodo efficiente per la preparazione di liposomi in modo controllato, riproducibile e ad alta produttività. La microfluidica consente di ridurre i volumi utilizzati e i costi associati grazie alla gestione dei fluidi in compartimenti geometricamente limitati, tipicamente caratterizzati da scale di lunghezza dell’ordine dei micrometri e da bassi numeri di Reynolds.
Generatore di goccioline
La focalizzazione del flusso microfluidico è uno dei primi metodi introdotti e consiste nell’uso di chip microfluidici con una geometria a flusso incrociato per garantire l’intersezione tra un flusso centrale di una soluzione alcolica contenente i fosfolipidi e una soluzione acquosa. In genere, tre flussi si uniscono nello stesso canale microfluidico, come mostrato nella Fig. 2. Questo è lo schema tipico dei dispositivi microfluidici adatti alla generazione di goccioline (clicca qui per vedere alcuni esempi). Come si può notare, una soluzione alcolica di fosfolipidi viene iniettata in un canale centrale affiancato da due soluzioni acquose laterali. Il flusso contenente i lipidi viene focalizzato e, grazie 1) al basso numero di Reynolds e 2) alla diffusione dominata dal trasferimento di massa, l’alcol si diffonde nella soluzione acquosa e la sua concentrazione nel flusso centrale inizia a diminuire. Quando raggiunge una concentrazione critica inferiore alla solubilità dei fosfolipidi, questi ultimi si organizzano spontaneamente in liposomi attraverso un processo di autoassemblaggio. Il rapporto tra le portate volumetriche dei flussi della fase lipidica e di quella acquosa, insieme alla portata totale, influenza la dimensione dei liposomi ottenuti e la loro regolazione consente una preparazione controllata.
La doppia emulsione è una variante del metodo di focalizzazione del flusso e consiste nella creazione di un’emulsione acqua-in-olio-in-acqua, in cui viene utilizzata una soluzione organica di toluene e cloroformio per l’evaporazione della fase oleosa durante la prima fase. Una volta rimossa la fase oleosa, i monostrati fosfolipidici che costituiscono le interfacce olio-acqua interne ed esterne entrano in contatto con la seconda fase acquosa e si assemblano in liposomi.
Questo metodo è tecnicamente complesso poiché richiede l’uso di due chip diversi collegati in sequenza, il primo con rivestimento idrofobico e il secondo con rivestimento idrofilo. L’efficienza potrebbe inoltre risultare bassa a causa della fase di emulsificazione, durante la quale le dimensioni delle vescicole e la velocità di preparazione influenzano fortemente 1) la loro stabilità e 2) la concentrazione di fosfolipidi alle interfacce olio-acqua. Pertanto, se i liposomi sono troppo piccoli o si formano troppo rapidamente e i fosfolipidi non sono ancora stabilizzati all’interfaccia, le goccioline tendono a rompersi facilmente e a rilasciare il loro contenuto, riducendo l’efficienza di incapsulamento.
Miscelatore a spina di pesce
Recentemente è stata studiata la tecnica di micromiscelazione mediante il metodo “Herringbone”, che presenta notevoli vantaggi rispetto agli altri metodi di preparazione in termini di efficienza nella produzione di liposomi.
Ad esempio, i liposomi PEGilati sono stati preparati con successo utilizzando un miscelatore a spina di pesce (clicca qui per ulteriori informazioni). Questo dispositivo è un miscelatore ad advection caotica in grado di interrompere il flusso laminare tipico dei microcanali e di ridurre il tempo necessario per il processo di preparazione dei liposomi. La struttura specifica del dispositivo, costituita da scanalature a spina di pesce, ridistribuisce i fluidi creando un flusso trasversale all’interno del microcanale.
The vertices of the grooves are offset to approximately one third of the width of the channel and two counter-rotating vortices are created by the grooves. The subsequent set of herringbone groves with a mirrored orientation of the vortices allows the creation of a full mixing cycle as shown in Fig.3. The alternation of these herringbone sets reorients the flow periodically and strongly improves the mixing. This microfluidic preparation method allows the controlled creation of liposomes of different sizes (∼100 nm) and good dispersity (< 0.2). By changing the flow rate parameters and the formulations in terms of aqueous buffer, phospholipid concentrations, and composition it is possible to finely tune the production of liposomes with the desired features.
Considerazioni finali
È evidente che la microfluidica rappresenti unvantaggiocome metodo per la preparazione dei liposomi in numerosi ambiti di applicazione. Rispetto ai tradizionali metodi su macroscala o in batch,i metodi microfluidici consentono una preparazione ad alta produttività dei liposomi in modo ben controllato e riproducibile. Sebbene i progressi siano stati rapidi, sono ancora necessari ulteriori miglioramenti per affermare la microfluidica come metodo di riferimento per la preparazione dei liposomi sia in ambito di laboratorio che industriale.
Attualmente, sono due gli ostacoli principali all’affermazione della microfluidica come metodo privilegiato per la preparazione dei liposomi:
- Come evidenziato da Björnmalm et al. (2014),per i ricercatori senza esperienza nel campo della microfluidica è difficile avere accesso alle tecnologie microfluidiche
- Carugo et al. (2016) e Sackmann et al. (2014), invece, hanno evidenziatola mancanza di un supporto scientifico qualificato su come la microfluidica potesse soddisfare le loro esigenze specifiche
Si spera che la disponibilità sul mercato di un numero sempre maggiore di dispositivi microfluidici innovativi e la disponibilità alla condivisione delle conoscenze da parte di molti esperti nel campo della microfluidica possano oracolmare questa lacunae consolidare la posizione della microfluidica come metodo preferibile rispetto a quelli convenzionali. Darwin Microfluidics è impegnata in questa rivoluzione. Forniamo dispositivi microfluidici innovativi per la preparazione dei liposomi e il nostro staff, composto da scienziati esperti e PhDs , offre il supporto di cui i ricercatori hanno bisogno per avere successo nelle loro attività.
Bibliografia
- Björnmalm M. et al., Progettazione e valutazione di particelle per il rilascio di farmaci in dispositivi microfluidici. Journal of Controlled Release 2014, 190: 139.
- Cheung C. C.L. et al. - Jamal W. T. Produzione di liposomi stabilizzati stericamente mediante un micromiscelatore a spina di pesce sfalsata: effetto della composizione lipidica e del contenuto di PEG-lipidi. International Journal of Pharmaceutics 2019, 566: 687.
- Carugo D. et al., Produzione di liposomi mediante microfluidica: potenzialità e fattori limitanti. Scientific Reports 2016, 6: 25876.
- Deshpande S.eDekker C. Produzione microfluidica su chip di liposomi delle dimensioni di una cellula. Nature Protocols 2018, 13 (5): 856.
- Sackmann E.K. et al., Il ruolo attuale e futuro della microfluidica nella ricerca biomedica. Nature 2014, 507: 181.
- van Swaay D.eDeMello A. Metodi microfluidici per la formazione di liposomi. Lab on Chip 2013, 13: 752.
- Williams M. S. et al., Una guida pratica al miscelatore a spina di pesce sfalsata. Lab on chip 2008, 8 (7): 1121.
