El hígado desempeña un papel fundamental en las actividades metabólicas, como la regulación de los niveles de glucosa en sangre, la producción de proteínas plasmáticas, el metabolismo de fármacos y la producción de bilis [1][2], y presenta una estructura compleja desde el punto de vista morfológico y funcional [3].
Debido a su importancia, se ha investigado ampliamente en las últimas décadas para comprender los mecanismos del metabolismo de los fármacos y la toxicidad (DILI – Drug-Induced Liver Injury, o lesión hepática inducida por fármacos), así como enfermedades hepáticas como la hepatitis, la cirrosis, la fibrosis y el cáncer [4][5][6].
Breve descripción general de la estructura del sinusoide hepático
La vena porta hepática (proveniente del intestino) y la arteria hepática transportan la sangre al hígado, donde se mezcla en capilares denominados sinusoides y se recoge en la vena central hepática para ser devuelta al corazón.
El hígado está compuesto por unidades repetitivas, los lobulillos, de forma hexagonal, que consisten en hepatocitos (HC) dispuestos en estructuras de cordones alrededor de los sinusoides, separados por un espacio perisinusoidal, el espacio de Disse.
Los hepatocitos son las células parenquimatosas del hígado, implicadas principalmente en la síntesis de proteínas y bilis y en el metabolismo hepático, mientras que las principales células no parenquimatosas (NPC) son las células endoteliales sinusoidales hepáticas (LSEC), las células de Kupffer (macrófagos) y las células estrelladas. Los hepatocitos reciben los nutrientes de las células sinusoidales a través de intercambios a través del espacio de Disse [2] [7][8].
Modelos hepáticos in vitro diseñados mediante ingeniería
Un modelo de hígado en un chip: El sinusoide hepático artificial
Hemos decidido describir aquí el sinusoide hepático artificial desarrollado por Lee et al., quienes diseñaron una plataforma microfluídica capaz de recrear un microambiente fisiológico (condiciones de transporte de masa) para la siembra de hepatocitos primarios [11].
Detalles del diseño del chip
La plataforma microfluídica estaba compuesta por un canal para el flujo de nutrientes y fármacos y un compartimento celular para la siembra de hepatocitos empaquetados herméticamente.
De hecho, se ha demostrado que las altas densidades de células primarias permiten la formación de interacciones célula-célula con una viabilidad y actividad metabólica aumentadas.
Se incluyó en el diseño del chip una barrera de tipo endotelial permeable con forma sinusoidal, compuesta por un conjunto de microcanales paralelos, con el fin de (i) prevenir altas tensiones de cizallamiento que puedan resultar peligrosas para los HC y (ii) empaquetar los HC en el área celular.
¿Cómo fabricar un hígado en un chip?
Microfabricación de chips
SU-8 (un fotorresist negativo) se estructuró mediante fotolitografía sobre una oblea de silicio en dos etapas: se recubrió por centrifugación una capa de SU-8 de 1 µm de espesor para crear los canales de la barrera de tipo endotelial, y posteriormente se utilizó una capa de SU-8 de 30 µm para crear los canales para el flujo y la siembra celular.
A continuación, se replicaron chips de polidimetilsiloxano (PDMS) a partir del molde de SU-8 y se adhirieron a un portaobjetos de vidrio.
Diseño de los parámetros del chip para simular la microcirculación hepática
El chip se diseñó para garantizar un flujo volumétrico de nutrientes de 100 pL/s (para unos 250 hepatocitos cargados en el área celular), típico de la microcirculación hepática. Para ello, la anchura, la altura y la longitud de los canales se establecieron en (50 x 30 x 1200) µm y (2 x 1 x 30) µm para el canal de flujo y la barrera permeable, respectivamente.
Utilizando una sección transversal de los canales de la barrera de 2 x 1 µm, se aseguró un flujo convectivo bajo y, por tanto, una alta resistencia fluídica total (1000 veces superior a la del canal de fluido), facilitando así el transporte difusivo. De este modo, los hepatocitos estuvieron expuestos a tensiones de cizallamiento bajas y pudieron recibir nutrientes mediante difusión a través de la barrera.
Diseño de los parámetros del chip para controlar la carga de hepatocitos densamente empaquetados
El diseño de la barrera de tipo endotelial también permitió la carga de una alta densidad de hepatocitos sin dañarlos ni dañar la propia barrera.
Se verificó que la estrecha sección transversal de los canales reducía la deformación de la membrana celular en la interfaz.
Por lo tanto, un flujo positivo dirigió las células hacia la parte inferior del área celular sin obstrucciones, lo que dio lugar a un elevado empaquetamiento celular. Además, el incremento de la resistencia generado por las células determinó una disminución de la tasa de carga al final del proceso de siembra.
Chip microfluídico para cultivo de células primarias: Resultados y conclusión
Se cargaron hepatocitos primarios tanto de rata como humanos en el área celular y se evaluó la viabilidad celular hasta 7 días.
La plataforma microfluídica se perfundió de forma continua con medio de cultivo. Los resultados demostraron que ambas líneas celulares mantuvieron su viabilidad después de 7 días sin necesidad de recubrimiento de colágeno (necesario en los sistemas de cultivo estático).
Además, la alta densidad de células garantizó una elevada actividad metabólica gracias a los contactos célula-célula.
La revisión muestra cómo las plataformas microfluídicas pueden diseñarse para imitar con precisión funciones específicas de un tejido o un órgano. En este trabajo, se diseñó un dispositivo microfluídico compuesto por un canal de flujo, un área celular y una barrera permeable de tipo endotelial para reproducir las condiciones de la microcirculación hepática, mejorando la viabilidad de los hepatocitos y las interacciones célula-célula.
Revisión escrita por Alessandra Dellaquila.
Referencias
[1] Y. B. Kang et al., “Liver sinusoid on a chip: Long‐term layered co‐culture of primary rat hepatocytes and endothelial cells in microfluidic platforms,” Biotechnol. Bioeng., vol. 112, no. 12, pp. 2571–2582, 2015.
[2] C. H. Beckwitt et al., “liver ‘organ on a chip,’” Exp. Cell Res., 2017.
[3] Y. Du et al., “Mimicking liver sinusoidal structures and functions using a 3D-configured microfluidic chip,” Lab Chip, vol. 17, no. 5, pp. 782–794, 2017.
[4] L. A. Vernetti et al., “A human liver microphysiology platform for investigating physiology, drug safety, and disease models,” Exp. Biol. Med., vol. 241, no. 1, pp. 101–114, 2016.
[5] V. Natarajan, E. N. Harris, and S. Kidambi, “SECs (sinusoidal endothelial cells), liver microenvironment, and fibrosis,” Biomed Res. Int., vol. 2017, 2017.
[6] S. S. Bale et al., “In vitro platforms for evaluating liver toxicity,” Exp. Biol. Med., vol. 239, no. 9, pp. 1180–1191, 2014.
[7] A. J. Strain and J. M. Neuberger, “A bioartificial liver–state of the art,” Science (80-. )., vol. 295, no. 5557, pp. 1005–1009, 2002.
[8] C. Moraes, G. Mehta, S. C. Lesher-Perez, and S. Takayama, Organs-on-a-Chip: A Focus on Compartmentalized Microdevices, vol. 40. 2011.
[9] H. Tsutsui and S. Nishiguchi, Importance of Kupffer Cells in the Development of Acute Liver Injuries in Mice, vol. 15. 2014.
[10] G. H. Underhill and S. R. Khetani, “Bioengineered Liver Models for Drug Testing and Cell Differentiation Studies,” Cell. Mol. Gastroenterol. Hepatol., vol. 5, no. 3, pp. 426–439, 2018.
[11] P. J. Lee, P. J. Hung, and L. P. Lee, “An artificial liver sinusoid with a microfluidic endothelial‐like barrier for primary hepatocyte culture,” Biotechnol. Bioeng., vol. 97, no. 5, pp. 1340–1346, 2007.
