Los liposomas o nanopartículas lipídicas son vesículas cerradas que se utilizan ampliamente para la encapsulación de diferentes tipos de moléculas, como el ADN, las proteínas, los fármacos y/u otras sustancias químicas. En esta breve revisión, analizaremos los métodos de preparación más utilizados, prestando especial atención a la microfluídica.
La envoltura de un liposoma es una bicapa fosfolipídica que actúa como una membrana biomimética que encierra un compartimento líquido, tal y como se muestra esquemáticamente en la figura 1. Gracias a su biocompatibilidad extremadamente alta, los liposomas tienen aplicaciones útiles en diferentes campos, por lo que el desarrollo de métodos de preparación fiables reviste una gran importancia.
Independientemente de los métodos de preparación, los fosfolípidos son moléculas anfifílicas que, debido a su hidrofobicidad, se organizan espontáneamente en liposomas cuando se encuentran en soluciones acuosas. Este proceso reduce las interacciones desfavorables entre las cadenas acílicas hidrofóbicas y la fase acuosa circundante.
Según el método específico utilizado para la preparación de los liposomas, el tamaño, la lamelaridad y la dispersión de los liposomas obtenidos pueden variar considerablemente. Las vesículas lipídicas utilizadas en aplicaciones médicas suelen ser unilamelares y tienen un diámetro de ~100 nm.
Dispositivos microfluídicos para la preparación de liposomas
Los métodos más antiguos y tradicionales para la preparación de liposomas consisten en las denominadas técnicas a macroescala o por lotes, basadas en la deshidratación inicial de las películas lipídicas, seguida del proceso de hinchamiento y la manipulación mecánica final para crear las bicapas dispersas en agua. Sin embargo, estos métodos se caracterizan por una escasa reproducibilidad, un control limitado del proceso y un uso ineficiente de los materiales y reactivos.
Recientemente se ha estudiado la microfluídica como un método eficaz para la preparación de liposomas de forma controlada, reproducible y de alto rendimiento. La microfluídica permite reducir los volúmenes utilizados y los costes asociados mediante la manipulación de fluidos en compartimentos con restricciones geométricas, que suelen caracterizarse por escalas de longitud del orden de los micrómetros y bajos números de Reynolds.
Generador de gotas
La focalización de flujo microfluídico es uno de los primeros métodos introducidos y consiste en el uso de chips microfluídicos con una geometría de flujo cruzado para garantizar la intersección de un flujo central de una solución alcohólica que contiene los fosfolípidos con una solución acuosa. Normalmente, tres flujos se unen en el mismo canal microfluídico, tal y como se muestra en la fig. 2. Este es el patrón típico de los dispositivos microfluídicos adecuados para la generación de gotitas (haz clic aquí para ver algunos ejemplos). Como se puede observar, se inyecta una solución alcohólica de fosfolípidos en un canal central flanqueado por dos soluciones acuosas laterales. La corriente que contiene lípidos se concentra y, gracias a 1) el bajo número de Reynolds y 2) la difusión dominada por la transferencia de masa, el alcohol se difunde hacia la solución acuosa y su concentración en la corriente central comienza a disminuir. Cuando alcanza una concentración crítica inferior a la solubilidad de los fosfolípidos, estos se organizan espontáneamente en liposomas mediante un proceso de autoensamblaje. La relación entre los caudales volumétricos de las corrientes de la fase lipídica y la fase acuosa, junto con el caudal total, influye en el tamaño de los liposomas obtenidos, y su ajuste permite una preparación controlada.
La doble emulsión es una variante del método de focalización de flujo y consiste en la creación de una emulsión de tipo «agua en aceite en agua», en la que se utiliza una solución orgánica de tolueno y cloroformo para la evaporación de la fase oleosa durante la primera etapa. Una vez eliminada la fase oleosa, las monocapas de fosfolípidos que constituyen las interfaces internas y externas entre el aceite y el agua entran en contacto con la segunda fase acuosa y se agrupan para formar liposomas.
Este método plantea dificultades técnicas, ya que requiere el uso de dos chips diferentes conectados en secuencia, el primero con un recubrimiento hidrofóbico y el segundo con un recubrimiento hidrofílico. La eficiencia también podría ser baja debido a la etapa de emulsificación, durante la cual el tamaño de las vesículas y la velocidad de preparación influyen considerablemente en 1) su estabilidad y 2) la concentración de fosfolípidos en las interfaces aceite-agua. Así, si los liposomas son demasiado pequeños o se forman con demasiada rapidez y los fosfolípidos aún no se han estabilizado en la interfaz, las gotitas tienden a romperse fácilmente y a liberar su contenido, lo que reduce la eficiencia de encapsulación.
Mezclador en espiga
Recientemente, se ha estudiado la micromezcla mediante el método «Herringbone», que presenta grandes ventajas con respecto a otros métodos de preparación en cuanto a la eficiencia en la producción de liposomas.
Por ejemplo, se lograron preparar con éxito liposomas PEGilados utilizando un mezclador en espiga (haz clic aquí para obtener más información). Este dispositivo es un mezclador de advección caótica capaz de romper el flujo laminar típico de los microcanales y reducir el tiempo necesario para el proceso de preparación de los liposomas. El patrón específico del dispositivo, formado por ranuras en espiga, redistribuye los fluidos creando un flujo transversal en el microcanal.
The vertices of the grooves are offset to approximately one third of the width of the channel and two counter-rotating vortices are created by the grooves. The subsequent set of herringbone groves with a mirrored orientation of the vortices allows the creation of a full mixing cycle as shown in Fig.3. The alternation of these herringbone sets reorients the flow periodically and strongly improves the mixing. This microfluidic preparation method allows the controlled creation of liposomes of different sizes (∼100 nm) and good dispersity (< 0.2). By changing the flow rate parameters and the formulations in terms of aqueous buffer, phospholipid concentrations, and composition it is possible to finely tune the production of liposomes with the desired features.
Consideraciones finales
Es evidente que la microfluídica supone unaventajacomo método para la preparación de liposomas destinados a todo tipo de aplicaciones. En comparación con los métodos tradicionales a macroescala o por lotes,los métodos microfluídicos permiten una preparación de liposomas de alto rendimiento de forma bien controlada y reproducible. Aunque los avances han sido rápidos, aún se necesitan mejoras adicionales para consolidar la microfluídica como el método de elección para la preparación de liposomas, tanto en el ámbito del laboratorio como en el industrial.
En la actualidad, existen dos obstáculos principales que impiden que la microfluídica se consolide como método preferido para la preparación de liposomas:
- Según el estudio de Björnmalm et al. (2014),a los investigadores sin experiencia en microfluídica les resulta difícil acceder a las tecnologías microfluídicas
- Carugo et al. (2016) y Sackmann et al. (2014), por el contrario, pusieron de manifiestola falta de fundamentos científicos sólidos sobre cómo la microfluídica podría satisfacer sus necesidades específicas.
Esperamos que la disponibilidad en el mercado de un número cada vez mayor de dispositivos microfluídicos innovadores y la disposición de muchos expertos en microfluídica a compartir sus conocimientos puedan ahoracolmar esta lagunay consolidar la posición de la microfluídica como método preferible frente a los convencionales. Darwin Microfluidics está comprometido con esta revolución. Ofrecemos dispositivos microfluídicos innovadores para la preparación de liposomas y nuestro equipo de científicos experimentados, junto con PhDs , proporciona el apoyo que los investigadores necesitan para tener éxito en sus actividades.
Referencias
- Björnmalm, M. y otros, «Diseño y evaluación de partículas para la administración de fármacos en dispositivos microfluídicos». Journal of Controlled Release 2014, 190: 139.
- Cheung C. C.L. et al.-Jamal W. T. Producción de liposomas estabilizados estéricamente mediante un micromezclador en espiga escalonada: efecto de la composición lipídica y del contenido de PEG-lípidos. International Journal of Pharmaceutics 2019, 566: 687.
- Carugo D. et al., «Producción de liposomas mediante microfluídica: potencial y factores limitantes». Scientific Reports 2016, 6: 25876.
- Deshpande, S.yDekker, C. «Producción microfluídica en chip de liposomas del tamaño de una célula». *Nature Protocols*, 2018, 13 (5): 856.
- Sackmann E.K. y otros, «El papel actual y futuro de la microfluídica en la investigación biomédica». Nature 2014, 507: 181.
- van Swaay, D.yDeMello, A. «Métodos microfluídicos para la formación de liposomas». Lab on Chip 2013, 13: 752.
- Williams M. S. y otros, «Guía práctica sobre el mezclador en espiga escalonada». Lab on chip 2008, 8 (7): 1121.
